细胞活性检测除了CCK8和MTT外还有一个XTT检测方法哦!
细胞活性检测XTT法是一种检测细胞增殖和活性的方法。其检测原理是:XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物,可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物。当XTT与电子耦合共同使用时,甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。
在细胞活性检测实验中,将XTT试剂和电子偶联试剂按一定比例混合后,加入到待测细胞中,然后进行孵育。在孵育过程中,活细胞会将XTT试剂还原成甲肷产物,而死细胞则无法进行这种还原反应。通过检测甲肷产物的生成量,可以判断细胞的增殖程度和细胞活力。
使用XTT法进行细胞活性检测具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点。同时,该方法对细胞毒性低,适用于各类哺乳动物细胞活性的检测。
试剂与材料:
(1) XTT:用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L,过滤除菌,现配现用;
(2) 吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS):用PBS配制成220mmol/L,4℃避光保存20天;
(3) XTT/PMS:XTT与PMS按1:1混合(临用时混合)。
XTT法操作步骤:
(1)刺激增殖反应,按照一定比例将XTT试剂与电子耦合试剂混合,加入到细胞培养液中,继续培养一定时间;
(2) 于终止培养前2h,每孔加入XTT/PMS 20μl,混匀后再培养2h;
(3) 在酶标仪上450nm处测定光吸光度,参考波长为655nm。
【结果分析】
计算SI:SI=试验孔OD均值/对照孔OD均值
XTT法操作注意事项:
(1)丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。不同厂家的产品,质量、活性不同,其使用的最佳刺激量也不同,因而在实验前,应事先确定其最佳刺激量。
(2) 检测T细胞增殖反应,丝裂原用PHA或ConA;B细胞增殖反应用LPS或SPA;T、B细胞增殖反应则用PWM。
(3) 增殖反应的细胞应保持高活性,一般应≥95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂(如NaN3)或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外,增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。
(4) 细胞培养液应无菌、无支原体污染,特别是小牛血清应加热灭活补体,避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此,实验前应选择本底低的小牛血清。用人"AB"型血清或自体血清也应加热灭活补体。