在类器官培养实验中，很多研究者可能会遇到这样的情况：干细胞过度自我更新，导致细胞类型单一而分化受限；又或者干细胞过度分化，增殖能力不足，难以维持类器官的长期培养。更为重要的是，器官在生物体内也需要保持增殖与分化的平衡，如果不能很好的控制类器官的增殖与分化，也不能很好的模拟真正的器官。

那么，如何较好的平衡类器官的增殖与分化呢？

近期，一项发表在Nature Communications上的研究成果，为我们解决这个问题带来了思路。该研究团队开发出一种新型的肠类器官培养系统，该系统能够在单一培养条件下实现干细胞快速生长和细胞多样性的增加，尽可能地达到干细胞自我更新与分化之间的平衡。

该研究团队的研究思路如下：

假设增强类器官的分化潜能就是增强类器官干细胞的的分化潜能，为了建立兼具细胞多样性和高增殖能力的类器官培养系统，首先，利用CRISPR-Cas9技术构建LGR5-mNeonGreen报告系统，筛选出能显著提高LGR5+干细胞比例的小分子组合，并验证相应培养条件下的细胞多样性、和体内器官的相似性，然后，在筛选出的最佳小分子组合培养条件下，通过施加抑制剂和其他小分子调节干细胞分化和增殖之间的平衡，最终，得到能够兼顾高增殖能力和细胞多样性的人类小肠类器官（hSIO）系统。

基于这样的研究思路，科研人员通过建立“干性”增强的类器官系统、小分子功能分析确认以及信号通路分子调节等方法（可见附1），精确分析出调控哪些小分子和细胞因子的特定组合，可增强细胞多样性分化，以及哪些信号分子组合，可增强细胞的特定分化，并对关键小分子的作用机制进行了初步探究。

可见平衡类器官的增殖与分化，并非一个简单的实验，需要从类器官培养系统的分子层面去进行分析，才能最大程度地让体外类器官模型向体内器官靠近，得到理想的结果。

团队研究方法概述

建立“干性”增强的类器官系统：利用CRISPR-Cas9技术构建LGR5- mneongreen报告系统来标记LGR5+干细胞，优化小分子和生长因子的组合来模拟干细胞的体内生态环境，发现曲古霉素A（TSA或T，HDAC抑制剂）、2-磷酸- l -抗坏血酸（pVc或p，维生素C）和CP673451 （CP或C，PDGFR抑制剂）这3个小分子（TpC）的组合可以显著增加LGR5阳性细胞（肠道内干细胞）的比例。

在TpC条件下产生多样化和可塑性的细胞类型：单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析揭示了TpC系统生成的类器官在组成和结构方面与体内器官具有高度的相似性，TpC系统支持在类器官中产生动态和可塑性的肠道细胞群，具有产生多谱系和经历细胞可塑性的潜力。

小分子在系统建立中发挥重要作用：通过流式细胞术、免疫荧光染色、RT-qPCR、scRNA-seq等分析细胞标记物的表达变化，确认各小分子的作用机制。TSA通过靶向HDACMBD-NuRD复合物增强LGR5干细胞维持；iBET-151能够可逆地促进细胞增殖，抑制向分泌细胞分化。

施加特定的信号调节分子实现类器官谱系转变：通过调节Wnt、Notch和BMP等信号通路，可逆地从分泌细胞分化转变为增强增殖的肠上皮细胞系，或单向分化为特定的肠道细胞类型。

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