使用说明：1. 需要用户自己准备的耗材和试剂
a. PBS ，或PBS (pH7.2-7.6)。
b. 固定液(免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛P0099)。
c. 洗涤液(免疫染色封闭液，QuickBlock™免疫染色封闭液或，或PBS)。
d. 通透液免疫染色强力通透液，免疫染色洗涤液，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e. 内源性过氧化物酶封闭液(内源性过氧化物酶封闭液，甲醇或PBS配制的0.3%过氧化氢溶液)。
f. 去离子水或超纯水。
g. 根据实验要求：18×18mm盖玻片，6孔板或其它多孔板。
2. 检测体系的准备
a. 如下以6孔板或常规切片检测体系为例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，检测体系可以相应按比例缩小。
b. 如果检测的是悬浮细胞，请按常规的悬浮细胞的操作方式进行。例如和贴壁细胞相比，相关步骤需要增加离心步骤等。
3. 培养细胞的EdU标记及固定、洗涤和通透
a. 在6孔板中(如有必要可以加入盖玻片)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。
b. 配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM (1X)，用细胞培养液1:500稀释EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EdU的使用终浓度为10μM。但细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EdU掺入到细胞中的量，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。
c. 将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。例如设计终浓度为10μM，原先6孔板中的培养基为1ml，则将1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培养基体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2X的EdU工作液；或者可以减少工作液的体积并增加EdU的浓度，使最终培养液中的EdU浓度为10μM，例如2ml培养液中加入220微升0.1mM EdU。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议替换所有的培养液。
d. 继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18-25小时，孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟，推荐的孵育时间为5分钟；酵母细胞的细胞周期约3小时，推荐的孵育时间为20分钟，增殖的神经细胞其细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时，建议提高EdU的浓度；孵育时间大于20小时时，建议适当降低EdU的浓度。
e. EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室温固定15分钟。
f. 去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。
g. 去除洗涤液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色强力通透液P0097，免疫染色洗涤液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。
h. 去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。
i. 再用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育20分钟，以灭活内源的过氧化物酶。随后用洗涤液洗涤3次，每次2分钟。
j. 转步骤5。
4. 动物体内EdU的标记及切片样品的处理
EdU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例，其它动物体内EdU的标记请参考相关文献。
a. 对于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。EdU可以单独购买。
b. 4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。
c. 对于冰冻切片：
(a) 加入适量固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室温固定15分钟。
(b) 去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
(c) 去除洗涤液，用适量通透液(可以使用免疫染色强力通透液，免疫染色洗涤液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。
(d) 去除通透液，用适量洗涤液洗涤1-2次，每次3-5分钟。
(e) 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，例如冰冻切片快速抗原修复液(5X)，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
(f) 用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用洗涤液洗涤3次，每次2分钟。
(g) 转步骤5。
d. 对于石蜡切片：
(a) 脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，换新的无水乙醇3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟。75%乙醇3分钟。50%乙醇3分钟。PBS 5分钟。
(b) 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液，例如柠檬酸钠抗原修复液(50X)、改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)、 EDTA抗原修复液(50X)、柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X)、通用型强力抗原修复液(10X)、漂片抗原修复液(10X)，或者自行配制适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
特别注意：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
(c) 用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用洗涤液洗涤3次，每次2分钟。
(d) 转步骤5。
5. EdU检测
注意：本步骤六孔板中每孔的反应体系为500μl的反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应的体系分别为200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反应混合物。对于较小的孔，单位培养面积的液体用量已经适当增加，以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100-200μl的反应混合物。如下以六孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法，对于其它孔板或切片，仅每步溶液的用量按比例调整即可，其余方法相同。
a. 配制Click Additive Solution：对于，用1.3ml去离子水溶解一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于，加入10.4ml去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。
b. 参考下表配制Click反应液。注意：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；同时，Click反应液须在配制后15分钟内使用。

c. 去除上一步骤中的洗涤液。
d. 每孔加入0.5ml Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。
e. 室温避光孵育30分钟。孵育时需注意在多孔板的空隙中加水，或者对于切片宜使用湿盒(例如载玻片染色盒)来保持湿润，以尽量减少反应液的蒸发。
f. 吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
6. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制：
a. Streptavidin-HRP工作液的配制：
参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，须充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。

b. DAB显色液的配制：
按照每个样品使用0.2-0.4ml显色液的比例配制适量DAB显色液。等体积混合适量DAB显色液A和DAB显色液B，充分混匀后即为DAB显色液。注意：配制好的DAB显色液必须一次使用完毕，不宜冻存。
7. 样品的显色：
a. 在样品上加200μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟。
注意：Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆盖样品为准。孵育时需注意在多孔板的空隙中加水，或者对于切片宜使用湿盒(例如载玻片染色盒)来保持湿润，以尽量减少Streptavidin-HRP工作液的蒸发。
b. 用洗涤液洗涤3次，每次2分钟。
c. 滴加0.2-0.4ml DAB显色液，室温孵育5-30分钟。
注：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。
d. 用洗涤液洗涤3次，即可终止显色反应。如有必要可以使用适当的染色液进行复染，如伊红染色液、甲基绿染色液、苏木素染色液、DAPI染色液等。普通光学显微镜或荧光显微镜下观察并拍照记录。