DNA-蛋白质互作研究解决方案(下)
DNA-蛋白质互作研究解决方案(上)介绍了一些表观组学技术研究DNA-蛋白质互作,但是有了组学数据,通常还需要一些验证实验。
这次,我们来介绍DNA与蛋白质互作研究的验证实验。
荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。
双荧光素酶实验能够进行启动子活性检测、转录因子鉴定、miRNA 与LncRNA/circRNA/mRNA互作等。
图.转录因子IRF3对IFN-β启动子的调控作用
构建Luc-IFN-β启动子载体和IRF3的过表达载体后进行共转染实验,之后双荧光素酶报告基因检测显示转录因子IRF3对IFN-β具有调控作用
CoIP或GST-pull down是研究互作蛋白的技术。在DNA-蛋白质互作研究时,通常会发现,在调控DNA区域,会出现多个蛋白共结合的情况,此时可能是蛋白质不同亚型或者不同蛋白组成复合体后发挥调控功能。这种情况下,需要进行湿实验验证,CoIP或者GST-pull down是使用较多的技术。
酵母双杂交是将待研究的两种蛋白质分别克隆(融合)到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。