靶向疗法指能够特异性结合致癌分子、抑制致癌分子活性、促使肿瘤细胞死亡而不影响肿瘤周围正常组织细胞的治疗方式。目前针对突变后活性异常升高的致癌分子，部分靶向药物可有效抑制致癌分子活性，具有很好的疗效，但是，对于突变后活性降低的抑癌分子—TP53（tumor protein 53），则需要靶向药物能够重新激活其抑制癌变的活性，这对于药物开发来讲是几乎不可能完成的任务。
2021年3月5日，约翰霍普金斯大学医学院Zhou Shibin研究组在Science发表论文，报道CD3双特异性抗体可靶向突变TP53抗原并杀伤肿瘤细胞。这篇文章以生物学机理研究为根基，巧妙地设计出在in vitro和in vivo实验中均具有高效杀伤肿瘤细胞的CD3双抗，令人眼前一亮，为开发针对突变TP53的靶向药物提供了新思路。
P53是人体内最重要的抑癌基因之一，扮演着人体基因组守护者的角色。正因为P53的重要抑癌作用，当其特定位点发生基因突变后，将导致抑癌活性降低，无法阻止癌症的发生。第175位赖氨酸（R）被组氨酸（H）替换是TP53 中最经常观察到的突变，也是其它肿瘤抑制基因中最常见的突变形式。P53R175H蛋白会被蛋白酶体降解，酶解片段HMTEVVRHC (带下划线的为突变氨基酸)可结合人类白细胞抗原 (HLA) 等位基因 (A*02：01) ，随后被加工和呈递到肿瘤细胞表面，产生可被T 细胞受体 (TCR) 可识别的新抗原（图1）。
图1. 靶向P53R175H双抗开发机理图
基于上述机理，研究人员利用噬菌体展示文库筛选出23株可特异性识别P53R175H、不识别P53WT的单链可变区抗体（scFvs），并将这些抗体同CD3ε抗体UCHT1 scFv组装成single-chain diabody (scDb)双抗（图2）。这类靶向TCR-CD3和抗原分子的双抗被称为T 细胞重定向双特异性抗体，其一端与肿瘤细胞结合，另一端以肿瘤选择性的方式触发 T 细胞的细胞毒作用和细胞因子的产生，可有效杀伤肿瘤细胞，占当前双抗开发种类的40%以上。
通过进一步筛选，H2-scDb这株抗体脱颖而出，其不仅能够高效激活T细胞分泌细胞因子，且与P53R175H/ HLA-A*02：01结合的特异性最好。
图2. 靶向TP53 scDb双抗示意图
在in vitro实验中，H2-scDb即使在很低的浓度时依然可以高效激活T细胞释放颗粒酶、穿孔素和细胞因子，介导肿瘤细胞的杀伤（图3）。
图3. H2-scDb in vitro杀伤肿瘤效果
在in vivo实验中，H2-scDb可显著抑制小鼠体内异种移植肿瘤的生长，而当肿瘤细胞的P53基因敲除后，肿瘤大小的增长不受到影响（图4）。
图4. H2-scDb in vivo杀伤肿瘤效果
为了阐明H2-scDb特异性识别P53R175H的分子机理，研究人员将H2以全长IgG的形式重组表达，然后利用木瓜蛋白酶将IgG酶解成Fab片段，再将H2-Fab与P53R175H/ HLA-A*02：01孵育形成复合物晶体，通过晶体学方法解析了该复合物的空间三维结构（图5）。
结构分析显示，P53R175H肽段（HMTEVVRHC）位于HLA-A*02：01分子α1和α2螺旋形成的空腔内，H2-Fab的6个CDR区域均与HLA-A*02：01有相互作用，但只有4个CDR区域与P53R175H肽段有相互作用（H1，H2，H3, L3）。
图5. H2-Fab与P53R175H/ HLA-A*02：01复合物的晶体结构
这项研究结果证明，针对P53R175H突变开发的双特异性单链抗体 H2-scDb 可以特异性识别和激活 T 细胞，发挥抗肿瘤作用，同时具有良好的安全性。目前这株抗体只在动物模型上获得了验证，期待后续这株抗体能够进入临床实验进一步验证。
常规的抗体治疗通常只能结合细胞表面的抗原，而肿瘤中大部分抗原是胞内抗原，这令抗体治疗常常束手无策。本研究中开发的H2-scDb抗体可以识别被呈递到肿瘤细胞表面的抗原肽/MHC 复合物，激活了 T 细胞的抗肿瘤效应，这为针对类似靶点抗体的研发、靶向实体瘤的 CAR-T 细胞疗法研发等提供了新的思路和证据。
在这项研究中，研究人员使用了ACROBiosystems开发的CD3E & CD3D异源二聚体蛋白（货号：CDD-H82W6）用于研究scDb与CD3蛋白的结合，获得了理想的结果。
ACROBiosystems优化开发了高度均一的高活性CD3δ/ CD3ε, CD3γ/ CD3ε系列产品，经非还原电泳和MALS技术严格确认为1:1异源二聚体，在抗体药物的开发和筛选、抗体药物的鉴定和质控、以及临床血药浓度分析等不同的应用技术平台中均表现出优异的性能，经双特异性临床抗体验证完全符合药物开发要求，可加速抗体药物的开发进程。
1:1异源二聚体，经NR电泳和MALS验证
Fig.1 Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His Tag&Tag Free (Cat. No. CDD-H52W1) on SDS-PAGE under reducing (R) and non-reducing（NR）condition. The purity of the protein was more than 85% and around 35-43 kDa verified by SEC-MALS.
高活性，批间差异小
Fig.2 Immobilized Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) at 1 μg/mL (100 μL/well) on Streptavidin (Cat. No. STN-N5116) precoated (0.5 μg/well) plate, can bind Monoclonal Anti-Human CD3 Antibody, Mouse IgG2a (Clone: OKT3) (Cat. No. CDE-M120a) with a linear range of 0.2-6 ng/mL (QC tested), and batch differences EC50<0.0001 μg/mL.
针对药物开发各应用场景开发
Fig.3 Immobilized Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) at 1 μg/mL (100 μL/well) on streptavidin precoated (0.5 μg/well) plate, can bind Monoclonal Anti-Human CD3 Antibody, Mouse IgG2a (Clone: OKT3) (Cat. No. CDE-M120a) with a linear range of 0.2-6 ng/mL.
Fig.4 Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) captured on Biotin CAP - Series S sensor Chip can bind Anti-Human CD3 Antibody, Mouse IgG2a (Clone: OKT3) with an affinity constant of 22.5 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) .
Fig.5 Immobilized Human BCMA, His Tag (Cat. No. BCA-H522y) at 2 μg/mL, add increasing concentrations of Bispecific T cell Engager (CD3 X BCMA) in 10% human serum and then add Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) at 0.2 μg/mL. Detection was performed using HRP-conjugated streptavidin with sensitivity of 15 ng/mL.
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参考文献：
Emily Han-Chung Hsiue et al. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation. Science, 2021, doi: 10.1126/science.abc8697.