ELISA试剂盒的那点事

酶联免疫吸附测定，又称酶联免疫吸附试验，即ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。1971年Engvall等人发表了使用ELISA定量测定IgG的文章，将1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

一. ELISA的原理

ELISA原理是将抗原或抗体包被在固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，检测过程种，通常使用洗板的方式去除非结合物，最终酶促反应后的底物的颜色，对样本中蛋白进行定性与定量。

ELISA常见主要试剂：

1.抗体；单抗特异性强，多抗结合性高，高端试剂盒需要高效的配对。

2.抗原；大多为重组蛋白,细胞因子和待测样本，高效标准品需NIBSC/WHO校准。

3.显色作用体系：首先辣根过氧化物酶（HRP）与常见底物TMB和OPD均可形成显色体系，再者碱性磷酸酶(AP)的底物为对-**苯***可形成黄色底物，还有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊显色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物为4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高强度荧光。

图1.ELISA常用试剂示意图

二. ELISA的类型

根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，按照原理及操作，市面最常用的方法有：

1. 间接法ELISA：

是检测抗体最常用的方法，原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检抗体，显色测定。优势在于待测一抗无需标记快速便捷。直接法ELISA与间接法ELISA相似，区别在于一抗酶标，检测孵育也以抗原为主，但直接法ELISA的灵敏度有限，需权衡使用。

图2:间接法ELISA示意图

2. 夹心法ELISA：

又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法ELISA，原理相似，用于检测抗体或抗原含量。以双抗体夹心法为例，捕获抗体包被在固相载体上，加入抗原或待测样本结合，后加入的检测抗体结合在抗原上，形成三明治夹心形式。双抗夹心法是市面最常见与方便分析的方法。

图3:双抗夹心法ELISA示意图

3. 竞争法ELISA：

小分子抗原与半抗原的检测方法常用竞争法ELISA，待检样本中抗原越多，被结合的酶标抗原的量会减少，彼此形成竞争负相关体系，显色物质也就越少，根据显色物质的比例可拟合得到待测抗原含量。

图4:竞争法ELISA示意图

4.其他方法：

a.免疫抑制法测ELISA：固相包被抗原，被检样本对底物显色的抑制程度与样本中所含抗原的量成正比，二者之差为待测抗原含量，原理类似与竞争法ELISA。

b.阻断ELISA:目的检测特异性抗体，也称为竞争ELISA，原理为固相包被抗原，待测样本与一抗酶标竞争孵育，待检样本中抗体越多，显色越浅，反则反之。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中涉及该法。

c.此外有用于检测IgM抗体的抗体捕捉ELISA，有固相载体改变的Dot-ELISA（**纤维素膜）和C-ELISA（涤纶布），还有技术分类的TRFIA和多因子检测等。

三. ELISA的评估

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

1.准确性：

a.回收率：测定试剂盒对数据真实性的校准，过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。

b.线性：测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性，过高或偏低均会出现测定的偏差。

2.精确度：

a.板内精确度：评价单次实验中，同一个已知浓度不同复孔的差异。

b.板间精确度：评价同一样本，多次实验的差异。

3.精密度：

最低检测限：能显著区分空白信号的最小信号值对应的最低浓度，用于评估试剂盒的灵敏度，值越低试剂盒灵敏度越高。

4.特异性：

a.交叉反应：评判特异性，不同分子与试剂盒抗体结合能力，交叉反应越大，特异性越差。

b.抗干扰能力：同源物的干扰，内源性物质对检测系统的干扰。

5.天然样本检测性：

对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定，避免假阳性或假阴性结果。

6.稳定性：

试剂盒时效性和稳定性是对指标检测的重要保障。稳定性越高，试剂盒存储时间越久。

图5：ELISA试剂盒产品分类

四. ELISA的应用

ELISA技术是特定靶标蛋白质定量的金标准，提供快速，稳定且易于分析的结果。可以对生物大分子/小分子的定量，对亲和力测定评价或者筛选，还可对重组蛋白或细胞因子进行活性比对分析等运用。常应用于细胞因子，趋化因子，生长因子等检测，同时应用于癌症、干细胞、免疫学、神经学和信号转导等研究领域的靶标。

图6.ELISA的技术应用

在生物医药研究，细菌疾病和临床诊断中，ELISA作为成熟免疫的检测方法定量检测出所需研究的细胞因子，抗原等物质，应用十分广泛，了解ELISA并选择合适的试剂盒，会让研究事半功倍。