项目文章|赫捷院士课题组nature子刊揭示METTL3以m6A依赖的方式调控食管鳞癌-技术前沿-资讯-生物在线

本期分享云序客户中国医学科学院肿瘤医院赫捷院士团队2021年6月21日发表“METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding”的文章，作者发现食管鳞状细胞癌组织中mettl3高度表达，运用m6A-MeRIP-seq和RNA-seq的发现METTL3上调APC 的m6A修饰，从而招募YTHDF降解APC 。APC表达减少后增加了β-catenin和β-catenin介导的cyclin D1、c-Myc和PKM2的表达，从而促进小鼠有氧糖酵解、ESCC细胞增殖和肿瘤形成。此外，APC表达下调与人食管鳞癌标本中metll3表达上调及食管鳞癌患者预后不良相关。文章揭示了ESCC细胞通过METTL3/YTHDF偶联下调APC从而使中Wnt/β-catenin通路更活跃，这一发现为肿瘤治疗提供新的理论基础。云序生物有幸参与了本次研究当中的m6A-MeRIP-seq和RNA-seq的测序服务以及生信分析。

发表期刊：Nature Communications
发表日期：2021年6月21
影响因子：14.919
研究方法：m6A meRIP-seq、RNA-seq
文章链接：METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediatedby APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding

研究内容：
（1）METTL3上调与ESCC患者的低生存率相关

为了探讨METTL3在食管鳞癌中的表达情况，作者分析了TCGA数据发现与邻近正常食管上皮组织相比，食管鳞癌标本中METTL3的表达明显上调（Fig. 1a）。与此结果一致的是，对ESCC标本和邻近正常食管上皮组织进行免疫组化(IHC)染色（Fig. 1b，c）显示METTL3在ESCC组织中的表达水平显著高于相邻的正常组织。Kaplan-Meier分析显示，METTL3高表达的患者总生存时间短于低表达的患者（Fig. 1d）。同时METTL3 基因和蛋白（Fig. 1e）在9种不同的食管鳞癌细胞系中表达水平均高于正常食管上皮细胞。这些结果表明，METTL3在食管鳞癌中表达上调，且与食管鳞癌患者生存时间呈负相关。

（2）METTL3促进小鼠ESCC细胞增殖和肿瘤生长

为了确定METTL3在细胞增殖中的作用，作者对METTL3进行了敲降。结果表明，METTL3的敲降减少了细胞的增殖（Fig. 2a）和集落数量（Fig. 2b）。这些抑制作用通过在KYSE180中重组表达一个耐RNA干扰的Flag-tagged mettl3恢复（Fig. 2c，d）。然后用四环素诱导表达在KYSE450细胞中的METTL3。四环素处理增加METTL3的表达且呈剂量依赖性，相应增加了细胞增殖水平（Fig. 2e）和集落形成（Fig. 2f）。与野生型(WT)相比，在ESCC细胞中过表达METTL3不活跃的突变体不能显著促进细胞的生长和增殖（Fig. 2g，h）。这些结果表明，METTL3促进肿瘤细胞增殖依赖于其表达水平和完整的活性。

为了确定METTL3在小鼠肿瘤生长中的作用，将KYSE180或KYSE450细胞皮下注射到无胸腺裸鼠中。发现敲除METTL3可以减少肿瘤的大小（Fig. 2i）、体积（Fig. 2j）和权重（Fig. 2k）。与METTL3不活跃的突变体相比，WT METTL3过表达极大地促进了肿瘤的生长（Fig. 2l，n）。这些结果表明，METTL3的表达有助于小鼠肿瘤的生长。

（3）METTL3介导APC mRNA m6A的上调

为了确定METTL3促进肿瘤细胞增殖的机制，作者检测了METTL3在ESCC细胞调控中的作用。METTL3 KO降低了KYSE180细胞中总m6A丰度（Fig. 3a）。m6A meRIP-seq和RNA-seq发现KYSE180中motif序列与m6A共识序列RRACH一致（Fig. 3b）。m6A信号在终止密码子和3’UTR区富集（Fig. 3c）。METTL3 KO中1101个基因中1199 m6A峰发生差异变化，RNA-seq显示有2973个基因发生了差异表达。在这些基因中，包括APC在内的93个基因存在重叠（Fig. 3d）。在METTL3 KO中m6A-MeRIP-seq中GO分析CC部分显示，β-catenin敲除复合物的基因组中m6A水平显著降低，包括APC。APC是Wnt负调控因子，促进β-连环蛋白降解。m6A峰位于APC终止密码子区附近的最后一个外显子，METTL3的耗尽降低了APC 的m6A水平（Fig. 3e）。miCLIP数据分析显示，APC 上有三个腺苷碱基被甲基化，并且位于METTL3 KO 后APC m6A峰的降低范围内（Fig. 3f）。这些结果表明，METTL3调控APC 的m6A水平。meRIP-qPCR检测METTL3 KO后APC 中m6A水平明显降低（Fig. 3g）。相反，METTL3过表达增加了APC中的m6A水平（Fig. 3h），这一现象受METTL14敲除恢复。此外，用METTL3抗体的RIP显示，METTL3在KYSE180和KYSE450细胞中与APC结合（Fig. 3i）。这些结果表明，METTL3与APC结合，并以METTL14依赖的方式提高其m6A水平。

（4）METTL3调控APC mRNA中m6A上调从而抑制APC的表达
为研究METTL3依赖的m6A调控APC的表达，作者构建了一个荧光素酶报告基因，该基因具有完整的编码序列(CDS)包含WT或从3 '端突变的m6A APC 。荧光素酶分析显示，METTL3 KO极大地提高了WT APC的荧光素酶活性，而突变的APC提高了荧光素酶活性，并使该活性抵抗敲除METTL3的调控（Fig. 4a）。相反，METTL3过表达抑制WT APC的荧光素酶活性，但没有抑制突变体中APC的荧光素酶活性(图4)。这些结果表明，METTL3介导的m6A水平的上调抑制了APC的表达。
与这一发现一致的是，METTL3 KO增加了APC基因和蛋白的表达（Fig. 4b），而在KYSE450和KYSE180中重组表达METTL3则下调了这一增加（Fig. 4c）。此外，METTL3过表达降低了KYSE450细胞中APC的表达（Fig. 4d），而四环素剂量依赖性增加的METTL3表达水平与APC水平呈负相关（Fig. 4e）。相比之下，METTL3不活跃的突变体与其WT对应体不同，未能调节APC的表达（Fig. 4f）。值得注意的是，ESCC细胞中METTL3的消耗消除了METTL3过表达-降低的APC表达（Fig. 4g）。这些结果表明，METTL3介导的APC m6A上调协同抑制APC 基因和蛋白的表达ESCC细胞中的METTL14。

（5）METTL3增强的了APC mRNA的m6A水平而后YTHDF结合抑制APC的表达

m6A Reader与m6A修饰的mRNA结合，导致蛋白表达增加或减少。YTHDF1-3介导mRNA降解。RIP-qPCR检测，发现YTHDF2结合APC 的数量远远高于KYSE180中YTHDF1和YTHDF3的数量（Fig. 5a）而METTL3敲除后（Fig. 5b）被还原。这些结果表明，METTL3增加APC 的m6A极大地促进了YTHDF2与APC 的结合。

为了研究YTHDF2与APC结合在APC表达中的作用，作者敲除了YTHDF2而后APC （Fig. 5c）和蛋白（Fig. 5d）在细胞中的表达增加。YTHDF1-3的联合敲除进一步增加了APC 基因（Fig. 5e）和蛋白（Fig. 5f）在这些细胞中的表达。此外，荧光素酶报告实验发现YTHDF2的缺失增强了含有m6A的WT APC CDS序列驱动的荧光素酶活性。然而突变的APC增强了荧光素酶的活性，并使该活性抵抗YTHDF2 敲除的调控（Fig. 5g）。这些结果表明mett3增加APC 的m6A，随后结合YTHDF抑制APC的表达。

（6）METTL3降低APC表达，促进β-catenin介导的下游基因表达、有氧糖酵解、ESCC细胞增殖与肿瘤发展

APC功能的缺失可以稳定β-catenin，诱导下游基因的表达（如CCND1和MYC）。促进细胞周期进程，而cMyc（由MYC编码）通过上调糖酵解基因的表达来促进有氧糖酵解。METTL3缺失增强了KYSE180中APC的表达，降低了β- catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2的表达（Fig. 6a）。然而，METTL3过表达降低了KYSE180中APC的表达，增强了β-catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2的表达。此外，METTL3 KO降低了葡萄糖摄取（Fig. 6b）、乳酸产量（Fig. 6c）、细胞增殖（Fig. 6d）和细胞集落数量。值得注意的是，这种METTL3 KO引起的基因表达的抑制（Fig. 6a），糖酵解（Fig. 6b，c），细胞增殖和菌落形成在APC KO后大部分消失。这些结果表明，METTL3降低APC的表达，促进β-catenin介导的下游基因表达，有氧糖酵解和ESCC细胞增殖。

为了确定METTL3诱导的APC表达下调在小鼠肿瘤生长中的作用，作者进行了皮下注射实验。结果发现，METTL3的KO减少了肿瘤的大小（Fig. 6e）、体积（Fig. 6f）和重量（Fig. 6g），以及肿瘤组织中的乳酸含量，这一过程可通过APC KO恢复。此外，IHC染色显示，METTL3 KO增加了肿瘤组织中APC的表达，相应的β-catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2的表达降低（Fig. 6h，i）。这些结果表明，通过METTL3抑制APC表达促进肿瘤的发展。

（7）APC表达下调与METTL3在人食管鳞癌标本中的表达和预后差相关

为了确定METTL3抑制APC表达的临床相关性，作者进行了TCGA数据分析，显示APC 的表达为与食管鳞癌中METTL3 的表达呈负相关（Fig. 7a）。此外，对119对ESCC标本及其邻近正常组织进行基因表达谱分析，发现APC表达明显在ESCC中显著下调（Fig. 7b），免疫组化染色发现METTL3蛋白表达与APC蛋白表达成负相关（Fig. 7c，d），而与β-catenin蛋白表达呈正相关（Fig. 7c，e）。此外，APC的高表达与ESCC患者较长的总生存时间显著相关（Fig.7f）。上述结果说明APC表达下调与人类METTL3表达上调相关且导致食管鳞癌患者预后差。

点评：文章通过m6A-meRIP-Seq结合全转录组测序技术（云序提供），通过对测序结果比对分析确认m6A甲基化修饰对肿瘤抑制因子APC起着重要作用。其中去甲基化酶METTL3以依赖于m6A修饰的方式调控APC与YTHDF作用从而促进APC的降解。首次揭示了YTHDF结合METTL3介导的m6A修饰抑制APC的表达，导致Wnt/β-catenin通路在癌症中以一种外膜调控依赖的方式上调。METTL3/ ythdf偶联m6A调控APC关键调控的发现，可能为ESCC患者的治疗提供有前景的方法。

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