一、介绍
无机焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase，PPase）是一种自然界普遍存在的酶，PPase是主要以焦磷酸为底物的水解酶，参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸（Inorganic pyrophosphate，PPi）(P2O74-)的水解[1-2]。PPase是能将一分子的PPi水解生成两分子的正磷acid盐离子(如图1所示)，这个过程是一个高放能的过程，将多种代谢过程中产生的PPi水解，防止其过度积累，因此该反应可以偶联到一些不利于生物转化的过程中，从而促进热力学平衡向生物合成方向进行[3]。PPi是一种常见的代谢副产物，包括DNA、RNA、蛋白质、肽聚糖、脂质（例如胆固醇）、纤维素、淀粉和其它生物聚合物的生物合成过程中均会产生[2]。PPi也在蛋白质的翻译后修饰过程中形成，包括腺苷酸化、尿苷化和泛素化[2]。应该注意的是，二价金属离子是催化所必需的，最有效的是镁离子。镁离子可以催化酶的活性也可以与PPi形成复合物成为焦磷酸酶的反应底物。
图1 PPase的分解机制[4]
二、无机焦磷酸酶的类别
目前，自然界中存在两大类PPase：膜结合型焦磷酸酶(membrane-integral pyrophosphatase，M-PPase)和可溶性焦磷酸酶酶(soluble inorganic pyrophatase，s-PPase)。s-PPase又分为Ⅰ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅠ，s-PPaseⅠ)、Ⅱ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅡ，s-PPaseⅡ)和Ⅲ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase Family Ⅲ，s-PPaseⅢ)。M-PPase主要存在于植物、细菌以及寄生性生物中，可作为质子泵和Na+泵，在生物能的保存和传递中发挥重要功能。s-PPase主要存在于胞质内，广泛分布于动物、植物以及真菌体内，具有调节焦磷酸基团和磷酸基团比例，维持正常生命活动的作用。s-PPaseⅠ在不同生物中其寡聚物的状态不同，s-PPaseⅡ在所有生物中都以二聚体形式存在; s-PPaseⅢ是卤代烷脱卤酶的变体[5]，仅存在于少数细菌中进行卤代烷脱卤素酶的修饰，无明显的生物学特征。
目前，已经商品化的PPase主要有三种来源，分别为：大肠杆菌、酵母和耐热细菌。
（一）来自大肠杆菌的PPase
大肠杆菌来源的PPase是从携带E. coli PPase基因的重组E. coli中获得。该PPase为非耐热型PPase，基本在25℃进行反应。
图2 大肠杆菌来源PPase的六聚体[6]
（二）来自酵母的PPase
酵母来源的PPase是从重组E. coli菌株表达纯化的携带有从酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）克隆的PPase基因，该PPase为非耐热型PPase，基本在25℃进行反应。由于酵母系统表达的蛋白比大肠杆菌表达的更复杂，其功能也可能较为全面。
图3 酵母来源PPase的结构[7]
（三）来自耐热细菌的PPase
耐热性PPase来源于古细菌中生存在高温环境的嗜热菌。嗜热菌的酶对温度要求不敏感且可通过提高温度来加快动力学反应。从P.horikoshii中分离的PPase，其最适温度为88℃。在100℃和8M尿素的情况下均具有一定活性。市面上的耐热型PPase多是Thermophile Iitorails来源。
三、PPase的适用实验
PPase在生物体内发挥着重要作用，可以防止无机焦磷酸影响生物体的正常代谢，近年来随着生物催化剂的兴起，其体外功能也逐渐显现出来。PPase不仅能够在DNA测序反应、PCR和单碱基延伸反应中防止PPi的积累造成的反应抑制，其还用于体外转录过程，用以增加RNA的产量以及通过酶促合成增加GDP修饰糖的产量。此外，PPase还常用于量化释放PPi作为副产物的反应速率，例如单核苷酸多态性基因分型反应、病毒RNA依赖性RNA聚合酶的RNA合成和氨酰-tRNA合成酶活性[8]。
（一）DNA扩增
DNA合成中的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是以DNA为模板，在DNA聚合酶作用下加入四种核苷酸和引物在体外大量扩增DNA的技术手段，其中包括高温变性DNA解旋氢键断裂成单链，温度降低退火引物结合模板DNA，后温度升高在聚合酶的作用下以四种核苷酸为底物，从引物开始5’到3’端延伸，通过循环达到扩增的目的。在dNTP的结合中会有PPi产生，通过焦磷酸酶的作用将其水解，促进DNA的合成，由于该过程是高温反应，需要选用耐高温的PPase，使得能够正常水解PPi。
等温扩增技术是通过在不同活性的酶和特殊引物条件下，在恒定温度下快速扩增核酸的技术，其中应用较为广泛的包括LAMP环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）、重组酶介导等温扩增技术（recombinaseaided amplification，RAA）以及依赖解旋酶等温扩增技术(helicase-dependent amplification，HDA)。等温扩增技术的实验过程需要核苷酸参与，合成时产生的焦磷酸也可以在PPase的作用下水解，由于其中有些等温扩增技术采用的是高温反应，所以此过程也需要选用耐热型的PPase。
（二）RNA体外转录
RNA体外转录（In vitro transcription，IVT）是在聚合酶的作用下，以质粒DNA为模板，在4种NTP的参与下，体外合成RNA的一种技术。该过程也会有PPi的产生，在反应体系中加入PPase可以促进正向反应，避免过多的焦磷酸抑制反应，增加RNA的产量(如图4所示)。由于常规体外转录反应温度相对较低，所以可以选用酵母来源或者大肠来源的PPase。
近岸蛋白提供三种来源的PPase，包括酵母来源、大肠杆菌来源及耐热型PPase，均能水解PPi、增强DNA复制能力、提高RNA产量；除此之外，还提供酵母来源的GMP级别PPase。GMP级酵母来源PPase是利用大肠杆菌大规模发酵表达获得，药用规格原辅料生产，并严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留等，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程(如表1所示)，保障其生产过程及所涉及原辅料可追溯。
表1 GMP级酵母来源PPase质量要求
体外转录实验验证
图4：体外转录实验中，加入无机焦磷酸酶对RNA的产量有明显提升。泳道1为转录体系内添加了无机焦磷酸酶，泳道2未添加。
表2 相关产品清单
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目录号 |
产品名称 |
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Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade |
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Pyrophosphatase, Inorganic（yeast） |
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Pyrophosphatase, Inorganic （E.coli） |
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Thermostable Inorganic Pyrophosphatase |
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Vaccinia Capping System |
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mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase |
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DNase I |
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E. coli Poly(A) Polymerase |
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RNase R |
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RE057 |
BspQI |
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mRNA Enzymes DIBA Kit |
参考资料
[1]Ferjani A, Segami S, Horiguchi G, et al. Keep an eye on PPi: the vacuolar-type H+-pyrophosphatase regulates postgermina-tive development in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2011, 23(8): 2895-2908.
[2] Saha S, Mina B L, Gopinath K A, et al. Relative changes in phosphatase activities as influenced by source and application rate of organic composts in field crops[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(6): 1750-1757.
[3]Terkeltaub RA,Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.[J] .Am J Physiol Cell Physiol, 2001, 281: C1-C11.
[4]王磊. 嗜热无机焦磷酸酶的重组表达及催化特性分析[D].西北农林科技大学,2014.
[5]贤加欢,张美萍,孙春玉,王艳芳,王康宇,陈静,赵明珠,王义.可溶性焦磷酸酶的研究进展[J].基因组学与应用生物学,2019,38(09):4030-4035.DOI:10.13417/j.gab.038.004030.
[6]Valeriya R. Samygina, Inorganic pyrophosphatases: structural diversity serving the function.[J].Russ. Chem. Rev., 2016, 85 (5) 464 ± 476.
[7]Daouda, M. , Bouchra, E. , Roman, P. , Aurelio, S. and Abdelaziz, S. (2017) Inorganic Pyrophosphatases: Study of Interest.Advances in Bioscience and Biotechnology,8, 388-397.
[8]McMillan Lana J,Hepowit Nathaniel L,Maupin-Furlow Julie A,Archaeal Inorganic Pyrophosphatase Displays Robust Activity under High-Salt Conditions and in Organic Solvents.[J] .Appl Environ Microbiol, 2016, 82: 538-48.
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