NGS文库定量：快且准的Qubit or精确的qPCR，其实都不能少！

准确的文库定量分析对获得高质量测序数据十分关键。如果文库定量浓度偏高，则可能由于成簇不足导致测序数据产量少；而定量浓度偏低则可能簇间信号干扰导致产生低质量的数据，甚至导致测序失败；另外，随着测序仪测序通量的提升，往往会将多个文库合并到一起进行测序，需要按照测序数据量的要求，根据定量结果混合相应摩尔量的文库，以稳定产出各样本数据量，因此文库的精准定量至关重要。

NGS中的定量主要有两大系统，分别为基于实时荧光定量的qPCR和基于荧光光谱的Qubit定量方法。这两种方法都可以进行相对准确的文库浓度检测，但在实际应用中仍然存在一些差异。

Qubit定量

1. 定量原理

Qubit的原理是利用荧光染料结合在DNA分子上发出荧光，再对荧光强度进行测定从而得到核酸的浓度。荧光染料只有在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比。

2. 产品性能

即用型，5min实现准确定量

基于dsDNA HS Assay Kit for Qubit® 试剂盒研发的1×dsDNA HS Assay Kit for Qubit®，是一款即用型的Qubit预混液，将原有试剂盒中高浓度的浓缩染料预先稀释成工作液，操作的时候仅需将工作液与待测样本混匀即可通过Qubit® 荧光仪测定样本浓度，使用更方便。

产品特点

简便易操作：即用型预混液，无需配制工作液，操作简单，定量更省时

超高的灵敏度：64x梯度稀释精准定量，0.2 -100 ng dsDNA具有良好线性关系

超强的特异性：特异性检测dsDNA，对一些常规污染物具有极好的耐受性

染料结合速度快：2 min 内即可达到饱和，快速读取准确定量结果不用等

极高的稳定性：荧光信号持续3h，常温防止20d不影响定量准确性

图1. 产品稳定性测试结果室温存放2周仍保持稳定（测定值与理论值偏差<10%）

注：测试方法，选取2个浓度的dsDNA，分别使用4℃存放的Thermo#Q33230、4℃存放的Yeasen#12642、室温存放（约25℃）的Yeasen#12642在不同时间测定浓度值，每次测定值与第一次（记为0d）测定值计算偏差率。

图2.产品稳定性测试，超强稳定性，有效期内测试结果相关性高

3. 更简捷的操作流程

Qubit定量产品推荐

qPCR定量

1. 定量原理

qPCR法利用荧光检测技术与PCR技术相结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过实时监测整个PCR过程中荧光信号的变化情况，反映浓度的变化，最后通过已知浓度的标准曲线计算未知样品的浓度，以达到准确定量文库浓度。

由于其特异性引物仅会定量两端接头连接完整的文库，可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，因此qPCR法作为文库定量的金标准，准确性最高。

2. 产品性能

本产品是用于 Illumina® 平台高通量测序文库浓度绝对定量的专用试剂盒，提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中，DNA标准品包含经梯度稀释的六份420bp的双链DN**段溶液，浓度为20pM-0.0002pM；扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计，可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子；qPCR MasterMix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液，可在不同长度、不同GC或AT含量样本中高效、特异扩增。

产品特点

精准定量：精准定量完整测序文库，提高测序数据质量

适用性广：稳定有效的定量不同长度、不同GC含量的文库

便捷使用：试剂盒中包含ROX，方便qPCR仪器进行标准化

严格质控：批次间稳定性CV-5%

图2. 文库扩增曲线与标准曲线

图3. 不同GC含量文库模板所扩增熔解曲线特征峰单一

绿色38% GC文库；紫色50% GC文库；黄色70% GC文库。

小结

两种定量方法之间的检测结果相当！

Qubit方法：优点是快速！单个样本几秒钟内即可得到测序结果，直接输出浓度，非常直观；同时也可兼容大部分的酶标仪，进行批量样本定量，是常规文库定量、dsDNA定量的首选。缺点是检测的精确度略低，检测的是样本中所有的dsDNA，也包含未连上测序接头的DN**段，不能特异性的定量有效文库（有完整测序接头的文库）；

qPCR方法：优点是精确度非常高，特异性精准定量有效文库浓度，非常适用于测量珍贵样本以及文库上机pooling前的精准定量，另外在PCR-free的文库构建中，由于没有PCR富集有效文库的过程，因此也推荐使用qPCR的方法来定量完整的文库浓度，稳定测序产出。缺点是操作相对繁琐，检测时间较长。

总之两种检测方法各有千秋，NGS中根据需求选择合适的定量方式，最好的是两者结合，获得更高质量更稳定的测序结果。

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