1. 通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养并给予0-10微升特定的药物刺激。
2. 每孔加入10微升CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200微升，则需加入20微升CCK-8溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
3. 在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
4. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。
5. 将不同数量的HeLa细胞按照每孔100微升培养液接种到96孔板中，培养至细胞贴壁充分后，每孔加入10微升的CCK-8溶液孵育2小时后测定A450的检测效果图参考图2。检测效果仅供参考，实测数据会因检测仪器等的不同而存在差异。
图2. CCK-8试剂盒测定不同数量HeLa细胞的检测效果图。实测数据会因检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
常见问题：
1. CCK-8溶液对细胞的毒性大小如何？
CCK-8溶液对细胞的毒性非常低，通常观察不到细胞毒性。细胞在CCK-8法检测后仍然可以正常生长，并可以用于其它的细胞实验。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非该细胞极难获得，否则不推荐把CCK-8溶液孵育过的细胞用于其它实验。
2.如果吸光度值太低，可以采取什么办法？
a.适当增加细胞数量。
b.延长加入CCK-8溶液后的孵育时间。