活细胞示踪及常用试剂

细胞染色和示踪试剂是跟踪复杂环境中细胞的重要工具，广泛应用于细胞迁移、创伤愈合及干细胞分化研究。细胞示踪需要专门的探针染料，必须要对活细胞无毒性，还要同时具有多种荧光颜色可供选择，以便与不同的仪器激光波长和滤光片匹配，并能与抗体标记或其他细胞分析标记探针共染色。

常用的细胞示踪染料有以下几种：

① CMFDA

CMFDA 的英文全称是5-chloromethylfluorescein diacetate，是一种可自由透过活细胞膜对细胞进行示踪的荧光染料。

CMFDA是二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）的氯甲基衍生物，具细胞膜渗透性，不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，CMFDA中的亲脂性基团可被胞浆内非特异性酯酶水解，生成5-氯甲基荧光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基荧光素可发出绿色荧光， 因带电荷而不能自由穿透细胞膜，并利用自身氯甲基与细胞内蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巯基转移酶作用下生成加合物，能完好的保留在胞内。经CMFDA标记的细胞，荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数天（至少3天），因此非常适用于细胞分化和形态发生等研究。与常用的钙黄绿素和FDA相比，具有较长时间的细胞内信号保留特点。

在细胞分裂增殖过程中，CMFDA标记荧光可分配至两个子代细胞中，且具有不会使邻近细胞染色的功能（有极少情况下通过细胞间缝隙连接发生染色）。同时，CMFDA标记荧光还主要用于分析细胞间融合、细胞粘附及多药耐药转运蛋白的研究。此外，CMFDA还可用于与其他细胞示踪染料联合选择性标记感染细胞内的病原菌；与膜不通透性核荧光探针共同使用，可用于细胞活性研究。

客户实例：

CMFDA标记的人脐动脉平滑肌细胞粘付在对齐纤维基质上，纤维硬度增加的原理图和荧光图像。

标记类型：huaSMCs（即人脐动脉平滑肌细胞）

标尺: 200μm

引文出处：Bingcheng Yi, Yanbing Shen, Han Tang, Xianliu Wang, Bin Li, and Yanzhong Zhang. Stiffffness of Aligned Fibers Regulates the Phenotypic Expression of Vascular Smooth Muscle Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 6867−6880

② CM-Dil

CM-Dil是DiI的一种衍生物，通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞，适合监测细胞运动以及细胞定位分析。因具有良好的染料维持性，可用以追踪多次传代细胞的运动特性。其有着强而稳定的红色荧光（Ex/Em=553/570nm），与绿色荧光染料以及蛋白具有良好的荧光分辨性，适合做多重指标染色。CM-Dil可自由穿透质膜进入细胞，从而产生不具有膜渗透性的反应产物。经过几次传代此染料还可完好的维持在活细胞内，染料随着细胞分裂传入子代细胞内，但不会进入相邻细胞。至少在72小时内保持荧光信号（一般可传3~6代）。工作浓度下，此染料无细胞毒性，不会影响细胞活力以及增殖能力。

与Dil相比，CM-Dil水溶性更好一些，便于悬浮细胞和固定细胞染色溶液的制备；CM-Dil携带的CM基团（即氯甲基替代基团）能与多肽及蛋白上的巯基反应从而使该分子在醛类物质中保持稳定。与其他膜染料如DiI和PKH26不同，一些细胞经CM-Dil染色后，可在后续的固定，透化和石蜡包埋处理中维持稳定的标记，因此特别适用于同时做细胞膜标记以及后续的免疫组化，荧光原位杂交或者电镜观察的实验。

研究证实，CM-DiI标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注入体内，可以有效的显示移植细胞在活体组织中的迁移及分化。

客户实例：

外泌体通过CM-DiI孵化进行荧光标记，染料浓度为2μg / ml，37°C,孵育5分钟随后4°C，孵育15分钟。在100 000g, 70分钟,4°C超速离心移除多余的染料。标记的外泌体(红色)被纤维蛋白胶包裹。 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察纤维蛋白胶，Z-Stack扫描检测分布在凝胶中的外泌体。

激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式，即可实现此项功能。

标记类型：外泌体

标尺: 400μm

引文出处：Jiafu Mu, Jiahe Wu, Jian Cao , Teng Ma, Liming Li , Shiqing Feng，Jianqing Gao.Rapid and effective treatment of traumatic spinal cord injury using stem cell derived exosomes.Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 16 (2021) 806–815

③ CFDA, SE

CFDA, SE的英文全称是Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞示踪染料，不仅可用于细胞增殖的体外实验，还可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程。

CFDA, SE是二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）的衍生物，具细胞膜渗透性，本身不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，可被胞浆内的酯酶催化生成羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），可发强烈的绿色荧光，不能穿透细胞膜，能完好的保留在胞内。CFSE还可自发性并不可逆地与细胞内的氨基结合从而偶联到细胞蛋白质上，同时过量且未被偶联的CFDA, SE通过被动扩散回到细胞外培养基内，被后续清洗步骤所清除。经CFDA, SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月，因此非常适用于细胞群落分析。

CFDA, SE标记细胞的荧光非常均一，优于以前使用的其他细胞示踪荧光探针如PKH26，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均一。在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的一半，通过流式细胞仪（FL1通道）根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂一次（1/2的荧光强度），二次（1/4的荧光强度），三次（1/8的荧光强度），以及更多分裂次数的细胞。CFDA, SE可检测分裂次数多达八次甚至更多。经CFDA, SE标记的细胞可用于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染色的功能。CFDA, SE最常用于淋巴细胞的增殖检测，也可用于成纤维细胞，自然杀伤细胞，造血祖细胞等其他细胞的增殖检测。

CFDA, SE标记细胞呈绿色荧光，Ex=494nm，Em=521nm，除了流式细胞仪检测细胞增殖外，还可用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。

客户实例：

人羊膜上皮细胞在体内迁移至损伤的子宫。 用CFSE对人羊膜上皮细胞进行标记后移植到小鼠体内。 绿色荧光染色表达率为100%。

标记类型：hAECs（即人羊膜上皮细胞）

标尺: 100μm

在人羊膜上皮细胞移植到损伤的子宫中3天后，免疫染色显示出CFSE标记的人羊膜上皮细胞(箭头所示)，而未进行人羊膜上皮细胞移植的宫腔粘连小鼠未检测到荧光染色的人羊膜上皮细胞。

标记类型：hAECs（即人羊膜上皮细胞）

标尺: 200μm

引文出处：Boning Li , Qiuwan Zhang, Junyan Sun and Dongmei Lai.Human amniotic epithelial cells improve fertility in an intrauterine adhesion mouse model. Stem Cell Research & Therapy (2019) 10:257

④ CellTrace™ Red CMTPX 细胞质红色荧光探针

CellTrace™ Red CMTPX细胞质红色荧光探针可以轻易穿透活细胞膜进入细胞内，转变成不具细胞渗透性的反应产物，发出较强荧光信号。随着细胞的传代增殖，该染料会转移到子细胞而非群体中相邻的细胞中，同时染料荧光信号至少可以保持72 h，该染料显示出较理想的示踪性能。CellTrace™ Red CMTPX染料表现出无毒、稳定、荧光信号持续时间长，且在生理PH环境中有明亮的荧光特性。此外，染料的激发和发射波长分别是Ex=577 nm和Em=602 nm，发出红色荧光，可以很好的与发出绿色荧光蛋白GFP一起使用，实现多重荧光检测。

⑤ Calcein,AM 钙黄绿素

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm，Em=515 nm）。 因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein, AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein, AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。

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