糖链抗原19-9（CA19-9）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

产品货号：L5E1005                                          

预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中糖链抗原19-9（CA19-9）的浓度，适用于胰腺，肝胆和胃癌患者的早期诊断，治疗的监测和监测癌症的复发。

概述

CA 19-9是SW-1116人结肠癌抗原在小鼠中制成的单克隆抗体19-9所识别的抗原，已证明其结构为唾液酸化的I型乳糖系岩藻五糖，共由6个糖基组成，也即唾液酸化的Lewis a抗原。人血清CA 19-9的上限为37000U/L（国外）或30000 U/L（国内），消化系统癌肿患者血清CA 19-9明显增高，如胰腺癌，肝胆系癌，胃癌和结肠癌分别可为正常均值（9400U/L）的683，535，279和115倍，阳性率分别为72.1%,66.7%，61.9%和19.0%，以胰腺癌为最高，故CA 19-9被认为是对胰腺癌较好的标志。消化系统以外的恶性肿瘤和良性疾患血清CA 19-9分别仅6.0%和1.3%（国外）超过上限，国内分别为16.7%和10%。CA 19-9诊断胰腺癌的灵敏度，特异性和PV（+）分别为69%~89%，75%~88%和54%~75%。其中对胰腺癌和肝胆系癌的阳性率均高于癌胚抗原CEA，对结直肠癌的阳性率均低于CEA，对胰腺癌的特异性也和CEA相仿或略高。约有5%~9%的胰腺炎患者，血清CA 19-9也有中等度的升高，一般不超过100000 u/L。有报导，仅约1/3的I期胰腺癌病人才见血清CA 19-9上升，故CA 19-9在胰腺癌早期诊断中的价值尚未肯定，但作为预后和病情追踪的指标则意见一致。胰腺癌手术后CA 19-9迅速降低，若重新上升往往是肿瘤复发的先兆。CA199临床临界值为37U/ml。

实验原理

用纯化的CA 19-9抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CA 19-9抗体的微孔中依次加入标本或标准品、HRP标记的抗CA 19-9抗体，经彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和标本中的CA 19-9含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测量吸光度（OD值），计算标本浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.          酶联板：一块（96孔）

2.          标准品：6瓶，0.5ml/瓶。CA 19-9浓度分别为0 U/ml，10 U/ml，30 U/ml，100U/ml，200 U/ml，400 U/ml。

3.          质控品：2瓶，0.5ml/瓶。CA19-9浓度分别为20-40 U/ml和160-240 U/ml。

4.          HRP标记的抗CA19-9抗体：1×10ml/瓶。

5.          TMB显色液：1×10ml/瓶。

6.          浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。

7.          终止液：1×5ml/瓶（2N H₂SO4）。

标本的采集及保存

1.          血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于5000 x g离心5分钟，取上清即可检测。。

2.          血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 5000 x g离心5分钟。

3.          细胞培养物上清或其它生物标本：请5000 x g离心5分钟，取上清即可检测。

注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过3个月，-80℃不应超过6个月；但皆应避免反复冻融。高血脂的标本不需进行特殊处理，可直接检测。，

操作步骤

1.          加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液40ul，余孔分别加标准品或待测样品40ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应45mins。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.          弃去液体，洗涤五次，拍干。每孔加HRP标记的抗CA 19-9抗体工作液100ul，37℃,45mins。

3.          温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，拍干。

4.          每孔加显色工作液100ul，室温避光显色，5分钟。

5.          依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6.          用酶联仪在405nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后立即进行检测。

注意事项：

1.          每次实验留一孔作为空白调零孔（不同于空白孔），该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液即显色液及2N H₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2.          一次加样最好控制在5分钟内，如标本量多，推荐使用多道移液器加样。注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一孔与最后一孔加样时间间隔若太大，会导致不同的 “预孵育”时间，从而影响测量值的准确性及重复性。

3.          如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

4.          严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温。使用后立即冷藏保存。

5.          洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。在加入HRP标记抗体溶液或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中以防让微孔干燥掉。为防止样品蒸发，酶标板加上盖或覆膜，洗板拍干后请立即加入后步试剂。

6.          消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

7.          请每次测定的同时做标准曲线，建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性：本试剂盒可同时检测重组或天然的糖链抗原19-9（CA19-9）。

检测范围：10.0U/ml – 400U/ml

最低检测限：5.0U/ml

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线（推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3），根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

说明

1.          只有全部使用LINC-BIO试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。

2.          在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，避免污染。

3.          试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时，仅适用于部分试剂，具体见标签）；2-8℃（频繁使用时）。

4.          浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

5.          刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

6.          本试剂盒有效期：6个月。

特别说明:本试剂盒仅供科学研究用.