transwell技术服务

transwell技术服务：
一类有通透性的杯状的装置；其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，杯子底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜）。该膜微孔的大小在0.1－12.0µm之间。
Transwell放入培养板后，分为两室：Transwell小室内称上室，盛装上层培养液；培养板内称下室，盛装下层培养液。上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
 
transwell技术服务应用
细胞种在上室内，因聚碳酸酯膜有通透性，故可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
根据transwell的特点（孔径，膜），可进行如下方面研究：
1.共培养                   孔径<3.0um
研究下室细胞B代谢物（分泌物）对上室细胞A的影响。
2.细胞趋化               孔径可选择5.0、8.0、12.0µm
研究进入下室的细胞量，反映下室成分对上室细胞的趋化能力
3.细胞迁移               孔径常选择8.0、12.0µm
研究进入下室的细胞量，反应上室细胞的迁移能力
4.细胞侵袭               孔径常选择8.0、12.0µm，膜上室侧铺有基质胶，
研究进入下室的细胞量，反映上室细胞的侵袭能力
 
具体应用例子
一、肿瘤细胞侵袭实验（transwell）
原理：
模仿体内细胞外基质，细胞只有分泌基质金属蛋白酶（MMPs），降解基质胶才可进入下室。
 
步骤
1.  Transwell小室准备
1）无基质胶Transwell小室制备
A. 包被基底膜：
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀释，无血清培养基作为稀释液
B. 取适量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul)，4℃操作。
C. 37℃培养箱中，孵育4-5h（>5h）；出现“白色层”时，说明已经变为固态。
 
2）有基质胶Transwell小室制备
A. 小室放入培养板中，上室加入300µl预温的无血清培养基
B. 室温下静置15－30min，使基质胶再水化
C. 再吸去剩余培养液。
 
2．细胞悬液准备
1）消化、收集细胞；
2）PBS洗1－2次
3）用含BSA的无血清培养基重悬（细胞密度约在1－10×105/ml）。
 
3. 细胞接种
1）取适量细胞悬液加入Transwell小室（按transwell说明）。24孔板小室一般200µl。
2）24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基。注意避免气泡产生（下层培养液和小室间）
3） 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。
 
4. 结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法：
1 ) 直接计数法
“贴壁”细胞计数:
 “贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
A. 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. 染色：常用的0.1%结晶紫染色。
优点：(1) 不需固定细胞，直接染色即可。
(2) 配制简单方便。
(3) 可以用33%醋酸脱色，测量洗脱液OD570值，间接反映细胞数
注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
C. 细胞计数：
(1) 显微镜进行观察和拍照
(2) 取3-5个视野计数细胞个数
 
2) 间接计数法
用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数。
MTT法
A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室浸没于其中，置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500µl DMSO，将小室浸没于其中，振荡结晶充分溶解。
D. 取出小室，测所得DMSO的OD值。
结晶紫检测
A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. （可选）甲醛固定30分钟，室温
B. 24孔板中加入500µl  0.1%结晶紫溶液，将小室浸没于其中，室温放置20分钟
C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸，将小室浸没于其中，脱色。
D. 取出小室，测量洗脱液OD570值。
优点：染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
 
5. 注意点
①Transwell小室：
注意是否是预先铺好胶
② 上层培养液：
上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，一般加入0.05%-0.2% BSA。
③ 细胞：
有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
④ 基质胶：
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel
⑤ 下层培养液：
下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。
⑥ 细胞培养板：
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
 
二、肿瘤细胞迁移实验（Transwell）
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。
步骤
1.Transwell放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，
2.在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释到所需密度），
3.放入细胞培养箱，培养一定时间后取出。
4.取出Transwell，用棉签擦去膜（内室一侧）的细胞
5.另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟
6. 结晶紫染色20分钟，
7. PBS或清水洗3次，
8.显微镜下观察细胞，记数。

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