微生物基因组重测序
产品名称： 微生物基因组重测序
英文名称： Microbial genome resequencing
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全基因组重测序是对基因组序列已知物种的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平进行差异性分析的方法。重测序能够检测全基因组的罕见变异，可以获得大量的单核苷酸多态性（SNP）信息、序列的插入缺失位点信息，还可以检测到多种结构变异（SV）和拷贝数变化（CNV）。
通过对获得的海量信息进行分析比对，能够发现或检测与疾病发生相关的序列位点信息，有助于理论科研、疾病诊断、药物作用靶点以及个体化诊疗的进一步发展，帮助客户在全基因组水平上扫描并检测与重要性状相关的基因序列差异和结构变异（SV），实现遗传进化分析及重要性状候选基因预测。
第二代测序技术与传统测序方式相比，具有耗时短、成本低、通量大等优势； 相对于芯片等杂交方法的模拟信号数字化，能保证数据结果更加准确。
一、技术路线
推荐平台：Illumina MiSeq、Illumina HiSeq 2000
二、生物信息分析
1. 原始数据整理、过滤及质量评估 2. 基因组重测序分析 l 与参考基因组比对（共线性） l 基因组岛鉴定 l SNPs和InDel的检测及在基因组的分布 l CNV和SV的检测及在基因组的分布 l 包含变异基因的COG和GO富集分析 l 包含变异基因的代谢途径分析（KEGG pathway） 3. 根据客户需求进行个性化分析 三、样品要求 1. 细菌：浓度≥200 ng/μl，总量≥50 μg，OD 260/280值介于1.8-2.0之间的细菌基因组DNA，并确保DNA无降解，无污染。 2. 真菌：样品浓度≥200 ng/μl，总量≥50 μg，OD 260/280值介于1.8-2.0之间的DNA，样品浓度越高越好。 3. 样品保存期间切忌反复冻融。 4. 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。 5. 提供DNA电泳检测照片，用自封袋密封后随样品一起送样。
四、经典案例
案例1 肺炎链球菌的基因组重测序
背景：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）一直是造成人类死亡的一个主要原因。出现在全世界的肺炎链球菌西班牙23F菌株是一个对多种抗菌素有抵抗力的特别棘手的菌株。
目的：利用Illumina高通量测序平台对1984年以来在全世界多个地点收集的这一世系的200多个分离株的基因组进行测序和比较，以便于剖析其演变过程。
结论：检测到57，736个SNPs，其中88%是由702个基因重组引起的，重组片段上的基因编码作为抗原的物质；发现了10次capsule-switching；多次观测到氟喹诺酮类，利福平和大环内酯耐药性的变化。
案例2 疟原虫基因组重测序
背景：疟原虫是人体疟疾的病原体，它严重危害到人类的健康。随着抗疟药物的广泛使用，疟原虫对几乎每一抗疟药都产生了抗性。
目的：利用Illumina高通量测序平台分别对3株疟原虫进行全基因组重测序，找到抗青蒿素相关的基因位点，为人们寻找抗疟新对策提供依据。
结论：通过与已测基因组比对，发现了大量的SNPs、InDel、CNV；在两株青蒿素抗性菌株中发现4个共有的点突变和4个特有的点突变。错义突变的发生与耐药性的出现具有同时性，从而确定了耐药性相关基因。
[ Hunt P, Martinelli A, Modrzynska K, et al. Experimental evolution, genetic analysis and genome re-sequencing reveal the mutation conferring artemisinin resistance in an isogenic lineage of malaria parasites. BMC Genomics, 2010, 11: 499-512 ]
五、常见问题解答
1. Q：如何验证重测序的结果？ A：通过全基因组重测序一般能够发现SNPs、SV、CNV、InDel等多种遗传变异，不同的变异类型，其验证方法也各不相同。① SNPs可以通过PCR扩增包含该SNP位点的区段，并进行测序；或采用SNPs分型检测的方法验证。② CNVs可通过Real-time PCR对存在拷贝数变异的片段进行扩增，并根据CT值估算不同个体的拷贝数变化倍数。③ 小的SVs可通过PCR扩增和测序辨别，而大的SVs则需要通过亚显微方法发现，如FISH等。④ 小片段的InDel，可通过PCR扩增，利用Sanger法测序进行验证。 2. Q：微生物基因组重测序有哪些用途和优势？ A：微生物基因组重测序在微生物遗传进化、疾病预防控制、生物工程技术、食品工业研究等方面都发挥着重要的作用，尤其是伴随着基因组测序技术的进步，对研究传染病的起源和病原微生物动态演变提供了较大的便易，从而促进了疾病预防以及诊断技术和新药开发。与传统测序方式相比，高通量测序具有耗时短，成本低，通量大等特点，相对于芯片等杂交方法的模拟信号数字化，保证数据结果更加准确。