◆ 概述
    细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30%的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。

    TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

◆ 操作流程
    ● 标本处理
    （1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，无水乙醇Ⅰ3min，无水乙醇Ⅱ3min，95％乙醇3min，75％乙醇3min，PBS洗5min。加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，用蒸馏水洗4次，每次2min，然后进行步骤2操作。
    （2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后进行步骤2操作。
    （3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5×107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后进行步骤2操作。
    ● 加入含3％H2O2的PBS，室温下5min。PBS洗两次，每次5min。
    ● 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
    ● 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应 1hr（阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。
    ● 将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。
    ● PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。
    ● 用PBS洗4次，每次5min。
    ● 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。
    ● 用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
    ● 于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。
    ● 脱水透明，干燥后封片，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

◆ TUNEL注意事项
    ● 使用PH中性的固定液固定组织或者细胞，避免使用酸性或者碱性固定液，以免出现人为DNA损伤；推荐使用3.7％甲醛溶液）
    ● 在操作过程中避免出现干片现象
    ● 根据标本类型决定孵育时间（蛋白酶K、TdT等），保证最佳效果
    ● 使用过程避免将TdT酶置于冰上；避免反复冻溶。
    ● 使用试剂盒提供的二价阳离子优化标记反应（Mg2+可降低背景，Mn2+可增强染色； 建议使用Co2+开始反应）
    ● 按照正确的顺序准备标记混合物；最后一步加入标记缓冲液
    ● 使用新鲜的H2O2溶液，孵育后立即将标本放入PBS清洗（H2O2可导致DNA损伤）