1 shRNA载体构建

siRNA载体构建：
    RNA 小片段可以通过化学合成或质粒载体转录获得。质粒载体的构建是将长约70bp的含有特定茎环以及终止信号的DNA分子插入到特定载体中，该DNA分子可以在细胞中转录为含有特定发夹结构的RNA双链分子。这些发夹RNA分子在细胞中被切割为19-23nt的双链RNA小片段，从而起到抑制特定基因表达的作用。
与化学合成siRNA相比，siRNA 质粒载体有以下优点：
    1. siRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达。
    2. 更加稳定和易控制。
    3. 可以用于稳定的细胞系建立。
    4. 可以用于诱变系统的建立。
    5. 可以建立基因敲除的小鼠模型。
    6. 含有GFP的载体可以用于监测转染效率。
    7. 可以源源不断的提供siRNA。
    8. 成本低廉。
缺点是：siRNA质粒载体的构建有一定难度，而且需要花费一定的时间。

朗日生物为您提供完善的siRNA质粒载体构建服务. 

9.2 microRNA分析与构建

microRNA简介
        microRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因榈母有院透丛拥幕虮泶锏骺赝?
      朗日生物为您提供microRNA载体构建技术服务，您只需提供您要做的目的基因序列及ID号，本公司专业的技术人员为您完成microRNA靶位点序列设计分析、及microRNA载体构建；

microRNA载体构建的特点及优点： 
      1. 超过70%成功阻断：利用BLOCK-It RNAi Designer设计软件，可快速高效地设计、克隆出双链寡核苷酸序列，构建出含Pol II启动子启动的用于RNAi分析的载体，用于RNAi分析，100%保证提供不少于70%的有效阻断（当以50nM转染，而且转染效率至少达80%时，一套中3条RNAi中至少有2条达到至少70%转录的阻断）； 
      2. 简单的表达跟踪：可通过同-顺反子表达Emerald Green Fluorescent Protein(EmGFP)和目的microRNA (miRNA)使得分析简单以及报告因子活性与阻断之间可靠的相关性 
      3. 多靶标阻断：同-顺反子（Co-cistronic）表达使得多个靶标同时阻断并且产生综合表现型。 
      4. 组织特异实验选择：通过选择广泛的目的载体或者Multisite Gateway应用，你可以加入你选择的启动子进行细胞内应用或者体内阻断，在哺乳动物细胞中可进行瞬时或永久的microRNA表达； 

microRNA载体构建技术服务流程：
1.microRNA靶点的预测 
     利用软件得到的目的microRNA的预测靶点。 
2.获得microRNA对应DNA模板
      根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增microRNA靶基因3’UTR序列。
3.microRNA靶序列克隆
      将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的miR-reporter载体中，连接产物转化大肠杆菌。
4.阳性克隆鉴定。
      挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。 
5.准备质粒，菌株
      抽提验证正确的质粒，定量。准备含有正确质粒的单克隆甘油菌株。 
6.产品包装，发货
      提供有microRNA靶序列的报告质粒，并免费提供阴性对照一份。甘油保存菌株各一支。