产品内容：

提取液：液体 70mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 20mL 提取液充分溶解备用；

试剂三：粉剂×2 支，4℃保存；用时每支加 1mL 双蒸水充分溶解备用；

试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；用时每支加 500μL 双蒸水充分溶解备用。

工作液：在 15mL 试剂二中加入 2mL 试剂三和 1mL 试剂四，可以根据比例现用现配。 产品说明：

ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME 催 化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢 的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧 化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。 NADP-ME 催化 NADP+还原成 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 增加速率。 

试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿、匀浆器和蒸馏水 

操作步骤： 

一、粗酶液提取：

细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g 4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。

组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置 冰上待测。 血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：

1、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中保温 15min 左右。

3、操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀后在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）， 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。

2、实验时，试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一 37℃或 25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水， 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

5、如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到 5 分钟或 10 分钟。

三、NADP-ME 活性计算：

1、组织中 NADP-ME 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V 样) ÷T=4823×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T =4823×ΔA÷W

2、细菌或细胞中 NADP-ME 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V 样) ÷T=4823×ΔA÷Cpr

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力 单位。

NADP-ME（U/10 4 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T=9.65×ΔA。

3、血清中 NADP-ME 活力的计算：

单位的定义：每 mL 血清在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷V 样÷T =4823×ΔA。 V 反总：反应体系总体积，9×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色 皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间， 1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

相关文献：

《Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data》 作者:Xiaofen Fu， Pengsong Li，Lei Zhang， Shizhong Li 期刊:Applied Microbiology and Biotechnology 影响因子:3.67 PMID:30673809