技术简介 

外泌体（Exosomes）是一种直径在40-100 nm的圆形单层膜结构，是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。外泌体可被大多数细胞分泌，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液中。外泌体中不仅包含蛋白质成分，还包括一些RNA成分，如微小RNA ( microRNA，miRNA)、长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）、mRNA和环状RNA（circular RNA，circRNA）。

LncRNA作为近几年研究最为火热的非编码RNA，其各种重要功能逐渐被发现，许多与癌症等恶性疾病密切相关。云序生物提供外泌体LncRNA测序，同时分析样品中所有外泌体来源LncRNA和mRNA，我们不仅为客户提供海量数据，更为客户甄别有效数据，提供出版级别经典图片。

云序优势：

一站式服务：

客户只需提供血清、血浆、体液或外泌体RNA，云序生物为您完成从样品准备，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。 

专业化的生物信息学分析：

云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求。
样本要求
样品类型：

血清、血浆、细胞上清、体液或外泌体RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量：

a）血清：5 mL

b）血浆：5 mL

c）细胞上清：20 mL

d）体液：

唾液：15 mL

鼻涕：15 mL

尿液：100 mL

脑脊液：10 mL

e）外泌体总RNA 4 μg （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5; 无明显降解，电泳检测样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾 ）

样品运输及保存： 

样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。 

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；血液样品应使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。 

数据分析 

1、差异LncRNA的筛选 

目的：筛选（Fold Change≥ 2,  P值≤ 0.05）两组或多组样品间的差异表达LncRNA。
注：Fold Change代表差异倍数，P值代表差异显著性，筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整

2、LncRNA靶基因共表达网络分析（CNC）

利用LncRNA与mRNA的共表达关系，构建LncRNA-mRNA共表达网络图，帮助发现LncRNA的靶基因，并推断LncRNA的功能。

3、LncRNA靶基因集信号通路富集分析（LncRNA-GSEA）

筛选与LncRNA共表达的靶基因，然后通过GSEA分析发现这些靶基因参与的信号通路，发现LncRNA参与调控的主要信号通路，帮助确定LncRNA的功能。

4、LncRNA临近靶基因GO和信号通路分析

搜索差异LncRNA的临近基因，然后用差异表达的临近基因进行GO富集分析和信号通路分析，了解LncRNA对临近基因的影响，并以此推断LncRNA参与的生物过程、分子功能和细胞组分。

5、LncRNA-miRNA-mRNA关联分析
一些LncRNA可以通过与miRNA结合，调节miRNA靶基因的表达。通过LncRNA-miRNA-mRNA关联分析，可以帮助推断作为miRNA海绵发挥作用的LncRNA以及作用机制。

6、LncRNA上游转录因子分析
预测特定LncRNA上游的转录因子结合位点，帮助判定该LncRNA所受的调控机制。

案例解析

案例1：外泌体LncRNA促进肿瘤细胞耐药性

原文：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

期刊：Cancer Cell 影响因子：27.41

本文阐述了疾病相关LncRNA参与肾癌耐药性及通过外泌体传播的生理机制。首先，作者通过高通量手段检测了野生型细胞和耐药型细胞中差异表达的LncRNA，并通过病人源性异种移植模型(PDX)鉴定到8条疑似致病LncRNA。将其中一条LncRNA-LncARSR (Activated in RCC with Sunitinib Resistance)敲除后，细胞耐药性显著增强。进一步研究表明LncARSR与肾癌细胞增殖、粘附等表型密切相关。作者研究发现，LncARSR主要存在于细胞外泌体中，并且耐药细胞外泌体LncRNA含量要远高于野生型细胞。作者随后通过RNA Pull Down实验证实核不均一性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)负责包埋LncARSR进入外泌体。当提取耐药细胞外泌体孵育到野生型细胞后，野生型细胞胞内LncARSR含量增加，细胞耐药性增强。而胞内LncARSR主要发挥miRNA海绵功能，通过竞争性结合miRNA-34和miRNA-449，促进AXL和c-MET表达及下游STAT3、AKT、ERK信号通路的活化，最终导致舒尼替尼耐药性形成。

图1. 耐药处理肿瘤细胞后外泌体内LncRNA发生差异变化

案例2：肿瘤缺氧环境促进外泌体癌症LncRNA高表达

原文：Hypoxic exosomes facilitate bladder tumor growth and development through transferring long non-coding RNA-UCA1

期刊：Molecular Cell 影响因子：7.78

为克服实体肿瘤的恶性缺氧微环境，肿瘤细胞会分泌大量含非编码RNA的外泌体，促进肿瘤的发生和转移。研究人员选取膀胱癌5637细胞系作为实验供体组，其具有LncRNA-UCA1（尿路上皮癌相关1型LncRNA）高表达的特点；膀胱癌UMUC2细胞系作为实验受体组，其具有LncRNA-UCA1低表达的特点。通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和蛋白质印迹分析分离并鉴定了在常氧及缺氧条件下5637细胞分泌的外泌体。将这些外泌体与UMUC2细胞共培养，发现来自5637细胞分离的缺氧外泌体会促进UMUC2细胞增殖、迁移和侵袭。与常氧状态培养分离外泌体相比，5637细胞系的缺氧外泌体中LncRNA-UCA1表达水平较高。此外，缺氧外泌体LncRNA-UCA1可以在体外和体内通过上皮间质转化促进肿瘤生殖生长。除此之外，膀胱癌患者血清外泌体中LncRNA-UCA1的表达水平显著高于健康对照组。本文证实缺氧膀胱癌细胞通过分泌富含致癌性LncRNA-UCA1的外泌体到肿瘤微环境中，促进肿瘤的生长和发育。并且，人血清外泌体LncRNA-UCA1具有作为膀胱癌诊断生物标志物的可能性。

图2. 肿瘤微环境影响外泌体LncRNA分泌