■焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术的原理

首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。 Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。 测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。掺入的 dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。 随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。

■系统用途：

多用途遗传分析系统，可应用于各种遗传多态性标记的分析检测，如SNP、突变、插入/缺失、甲基化、基因拷贝数等；等位频率分析；此外，还可应用于各种微生物的鉴定、分型、耐药性评估，并可对多种亚型或野生株及突变株、耐药株组成的复杂群体中的各个组分含量直接加以定量评估。

■服务项目：

1.SNP分型检测

优势： ◇ 单一位点的质量评估和序列信息
◇ 分析含有CpG位点的SNP
◇ 序列信息中不同位点的频率计算
◇ 适用于新鲜冷冻，和石蜡包埋的样本
◇ 不同的应用实验可同时在一次运行中实现
◇ PCR反应之后，1个小时内可同时平行分析96个样本
2.甲基化检测服务
基本流程 在表观遗传学的DNA甲基化研究中，新一代的测序方法可得到大量的全基因组甲基化特征数据，需要验证其中特定靶序列与表观遗传修饰的生理相关性。此验证过程较具挑战性，因为甲基化位点的位置和频率的微小改变也会带来明显的变化。焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是理想的验证方法。因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。 设计甲基化分析反应体系往往十分复杂，因为在非CpG位点胞嘧啶转化为胸腺嘧啶会影响引物的结合。为了解决这个问题，QIAGEN最近研发出了针对特定基因的预设计PyroMark CpG Assays，可覆盖整个人类基因组。这些试剂盒可用于CpG甲基化分析，并扩展了靶序列和CpG岛的选择范围。

优势： ◇ Pyrosequencing 能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域
◇ 启动子序列中接近的不同CpG岛的甲基化频率计算
◇ 适用于新鲜冷冻，和石蜡包埋的样本
◇ 不同的应用实验可同时在一次运行中实现
◇ PCR反应之后，1个小时内可同时平行分析96个样本

■项目流程：