高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光qRT-PCR检测试剂盒

一、简介

高致病性猪蓝耳病是引发猪“猪无名高热病”的主要病原体。可引发猪的大量死亡。临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。该方法采用一步法qRT-PCR，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Pig Reproductive & Respiratory Syndrome Virus)进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。

二、用途

本试剂盒适用于猪病料、鼻咽拭子、血液等样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒(Pig Reproductive & Respiratory Syndrome Virus)的特异检测。

三、试剂盒组成（48T/Kit）

四、储存条件及有效期

本试剂盒于-18℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围

ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取

6.1 样品的采集

（1） 猪病料：剪取50-100mg猪病料，加入装有500 µl PBS或生理盐水的研钵中缓慢研成匀浆，取匀浆液转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20sec；取上清备用。

（2） 鼻咽拭子：在装有鼻咽拭子的离心管中加入500µl PBS或生理盐水，剧烈振荡30sec。尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20sec；取上清备用。

（3） 血液：取样本至无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心1min，取上清备用。

6.2 样品RNA提取

可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。

（1） 取灭菌的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。

（2） 每管加入600 µL裂解液，分别加入被检样本200 µL，再加入200 µL氯仿，混匀器上振荡混匀5 s，于4℃ 12000 g 离心15 min。

（3） 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，加入-20℃预冷400µL异丙醇，吸取步骤（2）各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。

（4） 于4℃ 12000 g离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600µL 75％预冷乙醇，洗涤。

（5） 于4℃ 12000 g离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。

（6） 10000 g离心10 s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5 min～10 min。

（7） 加入10µL 无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000 g离心5 s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃ 冰箱。

注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤

7.1 试剂的准备

从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液（Hp-PRRSV-qRT-PCR MIX）、酶混合物（Enzymes MIX），冰上融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照（NTC）和阳性对照（Hp-PRRSV-PTC）5μL，10,000rpm瞬时离心10秒。

7.2 real time RT-PCR反应条件

将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。

推荐循环条件:

在60°C 延伸时收集荧光信号 。报告基团：设置为FAM。

八、结果分析

8.1 结果分析条件设定

 直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

8.2 试验成立判定

（1） 阴性对照（NTC）：不应产生任何的扩增曲线。 

（2） 阳性对照（Hp-PRRSV-PTC）：均产生扩增曲线。

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