产品内容：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入40mL蒸馏水，充分溶解。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解。

产品说明：

L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。

Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原氧化型细胞色素c（Cyt c），还原型Cyt c在550nm有吸收峰；测定还原型Cyt c增加速率，来计算Gal LDH活性。

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计、1mL比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约0.1g样品，加提取液1mL，冰上充分研磨，13000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测。

二、Gal LDH测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到550nm，蒸馏水调零。

2. 按样本数取出一定量的试剂一在25℃水浴锅中预热30 min以上，其余的分装保存(-20℃)。

3. 空白管：依次在1mL比色皿中加入100μL蒸馏水、800μL预热的试剂一和100μL试剂二，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值。

4. 测定管：依次在1mL比色皿中加入100μL上清液、800μL预热的试剂一和100μL试剂二，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值。

三、Gal LDH活性计算：

（1）按蛋白浓度计算

Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c 为1U。

Gal LDH (U/mg prot) = [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷（Cpr×V样）÷T

=0.289×(△A测定管-△A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样品每分钟还原1μmol Cyt c 为1U。

Gal LDH（U/g 鲜重）=[(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T

=0.289×(△A测定管-△A空白管) ÷W

    ε：还原型Cyt c摩尔消光系数，17.3×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径(cm)，1cm；V反总：反应体系总体积，1mL=0.001 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W：样品质量，g；T：反应时间，2min。

注意事项：

1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2、建议两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定OD值。