干细胞（Stem cell）即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

能自我更新和分化

具自我复制的能力

能在一定条件下分化成具有特定形态和功能的成熟细胞

胚胎干细胞

从囊胚期胚胎的内细胞团获得 胚胎生殖细胞与胚胎干细胞都可自发分化形成三胚层的全部细胞。

成体干细胞

特定的组织中能自我更新并分化成相应组织内具有特定功能的成熟细胞可塑。

一、培养条件

1. 环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统， 能够对整个房间进行杀菌的紫外灯

2. 设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。

3. 实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。

4. 试剤：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剤。

试剤的配制：

① DMEM培养基：去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3

② MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml链霉素

③ ES培养基：ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS, 1000u/ml青莓素，1000g/ml链霉素，1mM丙桐酸 钠，0.1mM非必须氨基酸，2mM谷氨酰胺，0.1mM筑基乙醇，1000u/ml白血病抑制因子

④ D-Hank's： 0.8%NaCI，0.04%KCI， 0.035%NaHC03， 0.006%KH2P04，0.005325%Na2HP04, 0.001% 酚红

⑤ 0.1%明胶：D-HanK's溶液中含0.1%的明胶

⑥ ES细胞冻存酒：90% ES培养基，10% DMSO

⑦ MEF细胞冻存酒：90% MEF培养基，10% DMSO

⑧ Feeder 细胞冻存酒：90% FBS , 10% DMSO

⑨ 丝裂莓素C：根据产品说明书来配制二、

培养步骤

常见的干细胞培养是胜胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEF）的复苏胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。

① 在37P水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。

② 把融化的细胞悬浮酒加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后,1000xg , 5min离心收集细胞。

③ 吸掉上清（除去冻存酒中的DMSO）,用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿 中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

④ 根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长滴整个培养皿，这时可以进行传代、冻存 或用于制备滋养细胞层。

2. 滋养细胞层（feeder cells layer）的制备

① 把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入 110μL 配好的丝裂莓素C,混匀后放入培养箱培养2h。 ② 把含有丝裂莓素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使 用该培 养基处理细胞5hh。用PBS（不含二价离子）洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37°C培 养箱放置约3min,直到细胞悬浮起来。

③用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000xg离心5min。

④ 去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1 %明胶处理过的细胞培养皿 中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37°C培养箱中至少 放 10min,之后把明胶吸掉即可）

⑤ 一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可 用来 培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。

3. 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, ES cells）的复苏

① 在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。

② 把融化的细胞悬浮酒加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中,轻轻混匀后,1000xg , 5min 离心收集细胞。

③ 吸掉上清（除去冻存酒中的DMSO,用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37°C,含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

④ 根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长滴整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。

4. 小鼠胚胎干细胞的传代

① 吸掉培养基，用PBS（不含二价离子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约 5min，直到细胞基本悬浮起来。

② 用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000xg离心5min。

③ 去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有 滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1：1到1：10。

5. 小鼠胚胎干细胞的冻存

① 吸掉培养基，用PBS（不含二价离子）洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞37°C培养箱放置约5min，直到细胞基本 悬浮起来

② 用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000xg离心5min。

③ 去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般 一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管）,按每管1 ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4°C20min, -20°C20min, -80°C过夜后迅速转入液氮中。

二、注意事项

1. 丝裂莓素C在操作时要避光，避免其分解。

2. ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格。

3. ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。

4. 为避免水或血清帯来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。