技术简介
m5C RNA是近年来发现的一类在tRNA及rRNA高丰度存在的甲基化修饰。利用高通量测序手段验证了非编码RNA以及部分mRNA中m5C广泛存在，但是在不同物种、不同组织中m5C修饰分布图谱尚没有系统性报道。云序生物率先开展m5C RNA甲基化测序服务，采用经典重亚硫酸盐处理的方式进行测序。在全转录范围内及tRNA水平查看基因m5C甲基化修饰水平。

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 云序生物（m5C）RNA甲基化测序流程

云序生物RNA甲基化测序产品

一站式服务：
客户只需提供组织、细胞、体液样品或RNA，云序生物为您完成m5C RNA-Seq全套实验服务。
严格的质控：
云序生物对m5C RNA-Seq实验每一步骤均设有关键质控，保证客户得到优质数据。
专业的生物信息学分析：
云序生物拥有专业的生物信息分析团队，帮助客户进行实验数据的全面挖掘。

样本要求
样品类型：
细胞、新鲜组织或RNA样品。其它类型样品请详询。
样品量：
a）细胞：1×10⁸ 
b）组织：1 g  
c）总RNA：50 μg （OD260/280：1.6-2.3；RNA无明显降解28S:18S>1.5或RIN>7）
样品运输与保存
样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。
样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

数据分析
1、识别RNA甲基化位点
通过高通量测序和生物信息分析，识别甲基化富集的基因组区域。

2、RNA甲基化位点的注释
富集峰识别后，得到的是一堆基因组位置信息，通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。

3、RNA甲基化位点在基因组中的分布
根据注释信息，绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。

4、RNA甲基化位点Motif分析
RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些 motif 特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif，从而揭示 RNA甲基化修饰的机制。

5、差异RNA甲基化位点的识别与注释
云序生物使用meRanCompare软件识别两个/组样品间的差异甲基化位点，以FDR<0.01作为阈值，具体的以测序报告为准。 识别样本间的差异甲基化区，发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

6、差异RNA甲基化位点的GO与信号通路分析
对差异甲基化基因进行功能分类，并发现显著性富集的功能条目。

案例解析
案例1：m5C RNA甲基化调控mRNA出核新机制

原文：5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

期刊：Cell Research 影响因子：15.60

中科院汪海林等研究团队揭示了m5C修饰在mRNA的分布图谱规律及其对调控mRNA出核作用新机制。研究人员建立了改进的RNA m5C单碱基分辨率高通量测序与生物信息分析技术，以此揭示mRNA m5C的分布规律，并绘制了精细的m5C修饰图谱，发现m5C在mRNA的翻译起始位点下游有显著富集，并且主要分布于CG富集区域。通过分析对比人和小鼠不同组织，发现m5C在mRNA上的分布特征在哺乳动物中十分保守，而在不同组织中修饰的基因具有特异性。研究团队同时发现，在小鼠睾丸发育过程中，动态的m5C修饰基因显著富集于精子发育相关功能，提示m5C修饰参与生殖发育调控。

图1. mRNA中m5C的分布规律及组织特异性表达

案例2: m5C RNA甲基化基因组分布图谱

原文：Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

期刊：Genome Biology 影响因子：13.21

近期刊登了解析RNA m5C在不同组织细胞的分布图谱相关文章。研究人员选取小鼠胚胎干细胞（ESC）和脑组织（n=3）作为实验样本，利用m5C RNA甲基化测序技术对两组样本中的总RNA和胞核RNA进行检测。结果表明，ESC中总RNA 5mC的分布频率比脑组织的分布频率更高。研究人员将m5C位点和不同的基因组区域（CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等）进行了关联分析。结果表明，总RNA中m5C位点更倾向于分布在转录起始位点。脑组织和ESC中，3’-UTR区m5C的分布区别很大，这暗示着3’-UTR区的RNA m5C修饰可能与细胞功能和细胞类型密切相关。

图2. m5C的基因组位置分布

案例3：拟南芥m5C RNA甲基化谱及TRM4B酶对根的影响

原文：Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

期刊：The Plant Cell 影响因子：8.23

与上篇不同，本研究团队采用m5C RNA甲基化测序研究拟南芥中m5C甲基化谱，在种子，幼芽，根中发现了1000多个特异性的位点。敲低RNA m5C甲基转移酶TRM4B，造成tRNA稳定性的降低。研究人员还证实TRM4B突变体的初级根比野生型更短，同时对氧化的应激反应更敏感。

图3. 拟南芥种子，幼芽，根中m5C位点