咖啡酸含量检测试剂盒 高效液相色谱法

品牌：Solarbio | 货号：BC4464

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

货号: BC4464      规格:50T/48S

产品简介： 咖啡酸，又名 3,4-二羟基肉桂酸，是一种天然的酚类化合物，广泛存在于一枝黄花、蒲公英、 升麻、缬草等中草药植物中。咖啡酸具有抗炎、抗病毒、抗氧化及免疫调节等作用，是一种重要的 医药原料。 咖啡酸在 323 nm 下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。

试验中所需的仪器和试剂： 高效液相色谱仪（C18 柱（4.6×250 mm），紫外检测器（VWD））、台式离心机、超声波清洗 机、鼓风烘箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、棕色 EP 管、针头式过滤器（50 个，有机系，0.45 µm）， 注射器，抽滤器，滤膜（有机系、水系各一个），棕色进样瓶（50 个，2 mL）、乙*（色谱纯，500 mL）、磷酸（分析纯，500 mL）、超纯水。 产品内容： 提取液：液体 100 mL ×1 瓶，4℃保存。 标准品：粉剂×1 支，4℃避光保存。临用前加入 1 mL 提取液配制成 1 mg/mL 咖啡酸标准溶液。

实验前准备工作：

1. 将 500 mL 色谱纯乙*和 500 mL 0.4%磷酸水溶液用滤膜抽滤，除去溶剂中杂质，以防堵塞色谱 柱。（乙*采用 0.45 µm 有机系滤膜抽滤， 0.4%磷酸水溶液采用 0.22 µm 水系滤膜抽滤）。

2. 流动相的配制：A：抽滤完毕的 500 mL 0.4%磷酸水溶液一瓶。B：抽滤完毕的 500 mL 色谱纯乙 *一瓶。将配制好的流动相超声 30 min，除去溶剂中的气体，防止压力不稳，影响实验结果。

3. 标准品的配制：将 1 mg/mL 的咖啡酸标准溶液采用倍比稀释的方法分别用提取液稀释成 100 µg/mL、50 µg/mL、10 µg/mL、5 µg/mL、1 µg/mL 的咖啡酸标准品溶液。（配制的标准品浓度仅供 参考，可根据实际样品浓度进行调整）。采用针头式过滤器过滤后待测。

操作步骤：

一、咖啡酸的提取：

将供试的植物样本在 60℃的鼓风烘箱中烘干，研磨成粉状，过 20~40 目筛。按质量（g）:提取 液体积（mL）1:10~20 比例（建议称取 0.15 g 烘干样品，加入 1.5 mL 提取液）加入提取液，然后60℃水浴浸提 20 min。10000 r 离心 10 min（25℃），取上清液（若溶液中仍存在固体可再次离心）。 将取得的上清液用针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内待测。

二、测定步骤：

1. 开启电脑、打开液相色谱仪各模块开关按钮，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量 为 10 µL，柱温：室温（约 27℃），流速为 1 mL/min，波长为 323 nm，使用乙* : .4%磷酸水溶液 =13 : 87 作为流动相，走样时间 15 min，设置完毕保存方法组。 2. 流动相清洗柱子，采用乙*：0.4%的磷酸水溶液 = 13:87 比例的流动相平衡柱子，待基线稳定后 开始进样。

3. 检测准备好的标准品溶液进样量为 10 µL，在 15 min 内可分离咖啡酸，咖啡酸的保留时间为 10 min 左右（体系、柱子等不同，保留时间有差异，仅作为参考）。检测完一个样后，重复步骤 2 清洗平 衡柱子，待基线稳定后加下一个样。计算不同浓度咖啡酸标准品的峰面积。

4. 检测准备好的样品溶液进样量为 10 µL，在相应的保留时间处检测咖啡酸的峰面积。检测完一个 样后，重复步骤 2 清洗平衡柱子，待基线稳定后加下一个样。

三、咖啡酸含量计算

以标准品浓度（µg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制咖啡酸的标准曲线，将样品的峰面积 代入标准曲线，计算提取液中咖啡酸的浓度 x（µg/mL）。

样本中咖啡酸的含量（µg/g）= x ×V 提取÷W=1.5x÷W V 提取：提取液的体积，1.5 mL；W：样本质量，g；单位换算系数，1 µg=10 -3 mg。

注意事项

1. 标准品的稀释倍数要根据样品中咖啡酸的浓度确定，样品中咖啡酸的峰面积必须在不同浓度的咖 啡酸标准品的峰面积之内，该标准品的稀释倍数只是一个参考。

2. 使用完毕后，需要用高浓度的有机相冲洗色谱柱，再按柱子的种类规范冲洗，防止损伤色谱柱。