柚皮素含量检测试剂盒（高效液相色谱法）

 注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 货号: BC4564 规格:50T/48S   产品简介： 柚皮素是一种二氢黄酮类化合物，独特的空间结构使得其成为了具有最多衍生物的黄酮骨架类物质。柚皮素具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗肿瘤形成与生长等活性。 柚皮素在 270 nm 下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。 试验中所需的仪器和试剂： 高效液相色谱仪（C18 柱（4.6×250 mm），紫外检测器（VWD））、台式离心机、可调式移液枪、研钵/匀浆器、棕色 EP 管、针头式过滤器（50 个，有机系，0.45 µm），注射器，抽滤器，滤膜（有机系、水系），棕色进样瓶（50 个，1.5 mL）、乙*（色谱纯，500 mL）、超纯水、磷酸（分析纯）、甲醇（分析纯）、5 mL 白色塑料试剂瓶、2 mL EP 管。   产品内容：  提取液：液体 90 mL ×1 瓶，4℃保存。  标准品：粉剂×1 支，4℃避光保存。临用前加入 2 mL 甲醇配制成 1 mg/mL 柚皮素标准溶液，4℃密封保存，避免阳光直射。     实验前准备工作：  1. 将 1.18 mL 磷酸加入到 500 mL 超纯水中，充分混匀，得到流动相 A。  2. 将 500 mL 色谱纯乙*（流动相 B）和 500 mL 配置好的流动相 A 用滤膜抽滤，除去溶剂中杂质，以防堵塞色谱柱。（乙*采用 0.45 µm 有机系滤膜抽滤， 配置好的流动相 A 采用 0.22 µm 水系滤膜抽滤）。  3. 将配制好的流动相 A、B 超声 20 min，除去溶剂中的气体，防止阻塞色谱柱，影响实验结果。  4. 标准品的配制：将 1 mg/mL 的柚皮素标准溶液采用倍比稀释的方法分别用甲醇稀释成 0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL、0.005 mg/mL、0.001 mg/mL 的柚皮素标准溶液（配制的标准品浓度仅供参考，可根据实际样品浓度进行调整）。4℃保存（密封），测试前采用有机系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内，待测（测试前请提前放置至室温状态，以免对保留时间造成影响）。     操作步骤：   一、柚皮素的提取：  将供试的植物样本在 60℃的鼓风烘箱中烘干，研磨成粉状，过 20~40 目筛。按质量（g）:提取液一体积（mL）1:10~20 比例（建议称取 0.15 g 烘干样品，加入 1.5 mL 提取液一）加入到试剂瓶中，称重，混合均匀，然后放入 80℃恒温水浴锅中，提取 2 h（建议使用丝口 5 mL 塑料试剂瓶，拧紧，防止在加热过程中瓶口崩开）。冷却后再次称重，加入提取液一补齐差值。密封，放入超声清洗机中，室温（25~35℃，超声时要注意温度不可过高）条件下超声提取 60 min。然后将提取浊液转移到 EP 管中，4℃条件下 10000 rpm 离心 10 min，取上清液（若上清液中仍有固体样本可再次离心），4℃保存（密封），测试前采用有机系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内，待测（测试前放置至室温状态，若上清液颜色过深或者浓度过高，可稀释后再次过滤待测）。  二、测定步骤：  1. 开启电脑、打开液相色谱仪各模块开关按钮，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量为 10 µL，柱温：30℃，流速为 0.8 mL/min，波长为 270 nm，洗脱程序如下表，走样时间 70 min，设置完毕保存方法组。 2. 采用相应的流动相清洗柱子，采用乙*：流动相 A = 20 : 80 比例的流动相平衡柱子，待基线稳定后开始加样。 3. 检测待测的标准品溶液，进样量为 10 µL，在 30 min 内可分离柚皮素，柚皮素的保留时间为 18.1min 左右（体系、柱子、流动相 pH、温度等不同，保留时间有差异，仅作为参考）。  4. 检测待测的样品溶液，进样量为 10 µL，在相应的保留时间处检测柚皮素的峰面积。 （如需连续检测可以按下表进行实验）      三、柚皮素含量计算  以标准品浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制柚皮素的标准曲线，将样本的峰面积代入标准曲线，计算提取液中柚皮素的浓度 x（mg/mL）。  柚皮素的含量（mg/g）= x ×V 提取÷W=10x V 提取：提取液的体积，1.5 mL；W：样本质量，0.15 g；单位换算系数，1 µg=10-3 mg=10-6g。 稀释后测试的样本，需要乘以相应的稀释倍数，再进行计算。       注意事项  1. 测试完毕后，关闭柱温箱加热系统，待柱温降到室温或以下，才可以停止流动相。  2. 测试完毕后，需要用高浓度的超纯水相冲洗色谱柱（约 20-30 个柱体积），以防阻塞色谱柱，再用高浓度的有机相冲洗色谱柱，最后按柱子的种类规范冲洗，防止损伤色谱柱。  3. 标准品的稀释倍数要根据样品中柚皮素的浓度确定，样品中柚皮素的峰面积必须在不同浓度的标准品溶液的峰面积之内，该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中柚皮素浓度过高，建议可稀释后再测。  4. 若样本量过多，建议每天测试一次标准溶液（一个标准品溶液即可），以确定相应的保留时间，所有待测溶液测试前必须放置至室温状态。