ADP含量检测试剂盒 高效液相色谱法

品牌：Solarbio | 货号：BC1014| 规格:  50T/48S

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 货号: BC1014 规格:50T/48S

产品简介： 二磷酸腺苷（ADP）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。在生物体内，通常为三磷 酸腺苷（ATP）水解失去一个磷酸根，即断裂一个高能磷酸键，并释放能量后的产物。 ADP 在 254 nm 下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。

试验中所需的仪器和试剂： 高效液相色谱仪（C18 柱（4.6×250 mm），紫外检测器（VWD））、台式离心机、可调式移液 枪、研钵/匀浆器、棕色 EP 管、针头式过滤器（50 个，水系，0.45 µm），注射器，抽滤器，滤膜 （有机系、水系），棕色进样瓶（50 个，2 mL）、乙*（色谱纯，500 mL）、超纯水。

产品内容：

提取液一：液体 80mL ×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 40 mL ×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 15 mL ×1 瓶，4℃保存。临用前取 3.5 mL 试剂一加入到 1000 mL 超纯水中，用试 剂二调节其 pH = 6.15，形成流动相 B，密封。

试剂二：液体 5 mL ×1 瓶，4℃保存。 标准品：粉剂×1 支，1mgADP，-20℃避光保存。临用前加入 2.34 mL 蒸馏水配制成 1 μmol/mL ADP 标准溶液，-20℃冻存。为了保证 ADP 的完整性，请避免反复冻融。

实验前准备工作：

1. 将 500 mL 色谱纯乙*（流动相 A）和 1000 mL 配置好的流动相 B 用滤膜抽滤，除去溶剂中杂质， 以防堵塞色谱柱。（乙*采用 0.45 µm 有机系滤膜抽滤， 配置好的流动相 B 采用 0.22 µm 水系滤膜 抽滤）。

2. 将配制好的流动相 A、B 超声 30 min，除去溶剂中的气体，防止阻塞色谱柱，影响实验结果。

3. 标准品的配制：将 1 μmol/mL 的 ADP 标准溶液采用倍比稀释的方法分别用蒸馏水稀释成 0.5 μmol/mL、0.1 μmol/mL、0.05 μmol/mL、0.01 μmol/mL、0.005 μmol/mL 的 ADP 标准品溶液。（配 制的标准品浓度仅供参考，可根据实际样品浓度进行调整）。采用水系针头式过滤器过滤到棕色进 样瓶内待测（测试前请提前放置常温状态，以免对保留时间造成影响）。

操作步骤：

一、ADP 的提取：

组织样本：按照组织质量（g）：提取液一体积（mL）1:5~10 的比例（建议称取 0.3 g 组织样本， 加入 1.5 mL 提取液）加入提取液一，冰浴匀浆，然后冰浴浸提 40 min。4℃条件下 10000 rpm 离心 10 min，取上清液 750 μL，加入 750 μL 的提取液二，充分震荡（5 min）混匀后，再次在 4℃条件下 10000 rpm 离心 10 min。取上清液，采用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内置常温待测(4 h 之 内)。

二、测定步骤：

1. 开启电脑、打开液相色谱仪各模块开关按钮，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量 为 10 µL，柱温：27℃，流速为 0.8 mL/min，波长为 254 nm，洗脱程序如下表，走样时间 70 min， 设置完毕保存方法组。

2. 流动相清洗柱子，采用乙*：流动相 B（pH=6.5） = 2 : 98 比例的流动相平衡柱子，待基线稳定 后开始进样。

3. 检测准备好的标准品溶液进样量为 10 µL，在 10 min 内可分离 ADP，ADP 的保留时间为 6.7 min 左右（体系、柱子、流动相 pH 等不同，保留时间有差异，仅作为参考）。

4. 检测准备好的样品溶液进样量为 10 µL，在相应的保留时间处检测 ADP 的峰面积。

三、ADP 含量计算

以标准品浓度（µmol/mL）为横坐标 x，峰面积为纵坐标 y，绘制 ADP 的标准曲线，将样品的 峰面积代入标准曲线，计算提取液中 ADP 的浓度 x（μmol/mL）。

样本中 ADP 的含量（μmol/g）= 2x ×V 提取÷W=3x÷W ADP 的含量（μg/g）=3x×427.2÷W=1281.6x÷W V 提取：提取液一的体积，1.5 mL；W：样本质量，0.3 g；单位换算系数，1 µg=10 -3 mg=10 -6g； MADP=427.2。

注意事项

1. 测试完毕后，需要用高浓度的超纯水相冲洗色谱柱（约 20-30 个柱体积），以防阻塞色谱柱， 再用高浓度的有机相冲洗色谱柱，最后按柱子的种类规范冲洗，防止损伤色谱柱。

2. 标准品的稀释倍数要根据样品中 ADP 的浓度确定，样品中 ADP 的峰面积必须在不同浓度的标准 品溶液的峰面积之内，该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中 AMP 浓度过高，建议可稀释后再测。

3. ADP，特别是提取后样品中的 ADP 在室温不太稳定，需尽快操作。