一、项目阐述 近年来，由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法。 iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。而在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～117)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息。 iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。而在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～117)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息。 虽然DIGE和ICAT已经广泛应用于蛋白质研究，但是iTRAQ作为一种新的蛋白质绝对和相对定量技术，具有很好的精确性和重复性，并且弥补了DIGE及ICAT的不足。 分析目标 寻找差异表达蛋白，并分析蛋白功能； 二、项目实验方案 iTRAQ作为近年来开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，结合非凝胶串联质谱技术，对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对定量研究。 1、样本还原、变性、半胱氨酸封闭； 2、胰蛋白酶消化蛋白； 3、消化蛋白的iTRAQ试剂标记； 4、混合标记蛋白到同一个试管内； 5、LC-MS/MS质谱检测及分析； 三、项目分析方案 差异基因筛选 我们利用统计学方法筛选差异表达的蛋白。一般认为高丰度蛋白鉴定出多个肽段，低丰度蛋白鉴定出较少肽段，因此检定出来的肽段数可以直接反映蛋白的表达量。我们认为经过检验校正的p-value: p<0.01的基因为差异表达基因。 GO数据库包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。Gene Ontology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。 对于每一种表达趋势的基因，选择性的进gene ontology功能分析。对差异表达的所有基因向gene ontology数据库的各节点映射。计算每个节点的基因数目，并结合整个数据库的基因作为背景分部，对于每个节点，得到一个2x2的表格，使用超几何分布检验基因在每个GO节点的富集或贫乏程度。 差异蛋白/基因之间相互网络构建。 找出差异表达基因在生物学通路中的位置，以阐明其生物学功能以及不同基因之间的相互作用。 1）、把差异表达基因定位在生物学通路（Pathway）上。 2）、统计分析，确定差异基因可否可以代表某些生物学通路 分析方法： 我们将差异基因使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway数据库映射，并统计基因在每个pathway中的富集程度（enrichment p-value）。 分析结果： 共找到n个相关的pathway（其中4个pathway p-value<0.05） 转录因子预测分析 利用相关的转录因子（TF）数据库，将差异基因的启动子(基因第一个外显子上游1000bp)提取出来。我们使用HsPD 提供的启动子序列。转录因子数据库使用TRANSFAC 7.0 public。转录因子结合位点预测使用pwmatch 程序，对每个转录因子分析其在上调基因和下调基因的分布情况，利用chi-square test 寻找有差异的转录因子。