iCD1小鼠iPS诱导完全培养基

iCD1完全培养基是一种无血清、无动物源污染、化学成分确定的高效获得小鼠诱导多能干细胞（iPS细胞）的培养基。该培养基可在无饲养层细胞、不分盘的条件下维持从体细胞向iPS细胞转化过程中的细胞生长和增殖，同时显著加速iPS细胞诱导进程，极大地提搞iPS细胞的转导效率。
优点
无血清、无动物源污染、化学成分确定
体系稳定，批次重复性
支持少因子诱导体细胞重编程
极大缩短iPS诱导时间（一周），提高iPS诱导效率（10%）
使用简便，无需添加额外的生长因子或其他添加物
 

 
iCD1培养基诱导iPS细胞操作步骤
成纤维细胞导入重编程因子->每天更换iCD1培养基->第7-8天挑取克隆


重编程效果

干细胞特异分子标记物Nanog和内源性Oct4的相对表达量被用于评价细胞整体重编程进程的快慢。图2a表明，在DeliCell^® iCD1培养条件下，Nanog 和内源Oct4的激活明显快于mES和KSR-BN组。图2b为蛋白水平上验证多能性分子标记物的表达结果图。结果表明，第8天在原盘出现的重编程克隆其多能性分子标记物Cdh1，SSEA-1和Nanog均有表达。图2c为将mES和iCD1培养条件下第4天和第8天的培养物提取总蛋白，采用Western-blot检测Nanog的表达状况，实验结果表明，感染后第8天，在DeliCell^® iCD1培养条件下， Nanog表达显著，而在对照组mES条件下，Nanog则未表达。该结果也进一步证明了iCD1培养条件下重编称过程显著加快。 

图2 从分子水平上证明DeliCell^® iCD1培养体系优于其他培养体系。

重编程后期外源因子沉默，是判断完全重编程的一个指标。图3为采用红色荧光蛋白Ds-Red用于模拟外源转录因子的沉默，将Ds-Red和OKS一起感染细胞，在DeliCell^® iCD1培养条件下，不同时间点，荧光显微镜跟踪观察细胞绿光（指示内源多能性Oct4的表达）和红光（指示外源因子的表达状况）。结果显示，随着时间的延长，绿光逐渐增强，红光逐渐减弱，第8天基本不表达红光，表明重编程后期外源因子的沉默，重编程基本完成。

图3 体细胞重编过程示踪

5.4.2采用iCD1和少因子（OK或OS）诱导小鼠多能干细胞

图4a是在DeliCell^® iCD1培养条件下，OK和OS重编程克隆的原始照片和传代照片。图4b表明OK和OS重编程获得的iPS克隆表达干细胞特异性分子标记。图4c为Oct4/KLf4和Oct4/Sox2重编程实验结果统计，表中给出了每次实验计算重编程克隆的时间和统计结果，三次试验结果表明试验具有较好的重复性。图4d为OK和OS克隆注射裸鼠长出的畸胎瘤组织切边，组织切片中明显的三个胚层的组织分化表明OK和OS克隆具备向三个胚层细胞分化的潜能。这些数据有力地证明了在iCD1培养条件下，少因子（OK或OS）能够将小鼠成纤维细胞诱导重编程。

图4 少因子的重编程实验

5.4.3 采用iCD1和单因子Oct4诱导小鼠多能干细胞

MEF细胞用Oct4病毒经过两轮感染后，在iCD1中培养，连续培养30天后，将培养物用胰酶消化传代种植到饲养层细胞上，用iCD1继续培养，在传代后的第5天左右，发现有绿色重编程克隆出现，如图5a所示。通过免疫荧光检测发现这些克隆均表达多能性分子标记如Nanog，SSEA-1 和Rex1，结果如图5b所示。图5c通过实时荧光定量PCR检测多能性marker的表达状况，结果表明这些克隆表达内源Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Dnmt3l的水平与标准的胚胎干细胞类似。图5d是通过实时荧光定量PCR方法分析外源基因的表达状况。OKS感染后4天的Oct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞作为阳性对照。结果显示挑取的这些重编程克隆，外源转录因子均已沉默。插入鉴定检测结果表明 (图5e)，挑取的克隆不是因为病毒污染引起。图5f为Oct4重编程克隆细胞注射囊胚产生的嵌合体小鼠。产生的嵌合体公鼠与白色品系小鼠产下全黑色小鼠（图5g） ,该结果证明Oct4重编程克隆为生殖系嵌合。上述结果证明严格证明Oct4重编程细胞与胚胎干细胞类似，从而证明了在iCD1培养条件下，Oct4可将小鼠胚胎成纤维细胞完全重编程。
 

1. 培养基相关文献列表：

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4. Chen, J. et al. BMPs functionally replace Klf4 and support efficient reprogramming of mouse fibroblasts by Oct4 alone. Cell research 21, 205-212 (2011).
5. Chen, J. et al. Vitamin C modulates TET1 function during somatic cell reprogramming. Nature genetics 45, 1504-1509 (2013).
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7． Liu, J. et al. The oncogene c-Jun impedes somatic cell reprogramming. Nature cell biology 17, 856-867 (2015).
8． Chen, J. et al. BMPs functionally replace Klf4 and support efficient reprogramming of mouse fibroblasts by Oct4 alone. Cell research 21, 205-212 (2011).
9．  Wang, Y. et al. Reprogramming of mouse and human somatic cells by high-performance engineered factors. EMBO reports 12, 373-378 (2011).
10.   Ouyang, J. et al. Cyclin-Dependent Kinase-Mediated Sox2 Phosphorylation Enhances the Ability of Sox2 to Establish the Pluripotent State. The Journal of biological chemistry (2015).