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  实验原理
    
      Real time PCR 是一种最新发展的定量PCR技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。
SYBR GreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。
SYBR GreenI在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于SYBR GreenI与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen I 得到定量结果。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（threshold value）。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。
 相对定量的计算方法:定量一般是在PCR扩增的指数期进行的PCR 指数扩增的公式是：Xn=X0×(1+EX)ⁿ(Xn是第n个循环后目标分子数,X0是初始目标分子数,Ex是目标分子扩增效率,n是循环数),任一样本q目的基因x 达到阈值时分子数Xqx=X0×(1+EX)CTx
任一样本q目的内标基因r 达到阈值时分子数Xqr=R0×(1+ER)ctr
Xqx=Xqr,X0×(1+EX)ctx=R0×(1+ER)ctr, X0/R0=(1+ER)ctr/(1+EX)ctx,目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照基因Y= 2 ^–ΔCt(ΔCt=Ct目的基因－Ct 内标基因)。

RT-PCR检测引物特异性

RNA电泳图

PCR扩增曲线

PCR溶解曲线