——即蛋白质药物氨基酸序列覆盖率技术服务

蛋白质多肽类药物往往拥有很长的氨基酸序列，在传统蛋白质化学领域，对这些分子进行序列分析需要进行诸如Edman降解法等的化学分析。但是，对于大多数蛋白质药物样品而言，化学测序方法都不能完成对整个氨基酸序列的覆盖（Edman降解法的测序极限，根据文献是70个氨基酸左右，APT为客户完成过50个氨基酸测序工作）。然而蛋白质类药物的理化性质分析中需要氨基酸序列的覆盖率信息，用以完善蛋白质类药物的理化性质信息。APT为客户提供基于shotgun方法的蛋白质多肽类药物的氨基酸序列覆盖率测定服务。

上图为shotgun方法的nano-spray离子源，可以用来使酶解后多肽分子电离，被质谱仪所分析。

“蛋白质类药物的覆盖率测定从方法学上类似于蛋白质组学的shotgun法”

技术指标

质谱方法对蛋白质多肽药物分子的肽段覆盖率进行分析的基本原理是将蛋白质分子选用特异性蛋白酶进行切割，酶解后的供试品为复杂的肽段组成的混合物，然后经过液相联用质谱仪进行检测。APT为提高质谱仪对肽段覆盖率的检测，采用Trypsin、Chymotrypsin、GluC三种酶切以提高覆盖率。

APT采用LTQ-Velos质谱仪（Thermo Finnigan, San Jose, CA）进行质谱分析。进样方式：Microspray；毛细管温度：200℃；检测方式：正离子；多肽和多肽碎片的质量电荷比按下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集20个碎片图谱（MS2 scan）。

LTQ-Velos产生的原始数据由Bioworks 3.3软件查库，搜索使用数据库为根据样品理论序列建立的蛋白库，数据筛选参数为：Xcorr ≥ 1.9（Charge 1），Xcorr ≥ 2.2（Charge 2）和Xcorr ≥ 3.75（Charge 3）。APT采用标准是二级质谱覆盖到的肽段覆盖率。

“多种蛋白质内切酶联合酶解，有利于提高氨基酸序列的覆盖率。”

“对于抗体样品的覆盖率实验，脱糖后分析有利于提高覆盖率。”

案例分析

由质谱结果（下图）可以看出三种酶酶切均较为充分。查库结果进行整合之后，最终得到该供试品轻、重链各自的覆盖率。

本供试品（下图）轻链氨基酸序列共有XXX个残基，匹配到的氨基酸残基序列共计XXX个残基，匹配到的序列占总序列的XX%。

供试品轻链的覆盖率（红色部分）

本供试品（下图）重链氨基酸序列共有XXX个残基，匹配到的氨基酸残基序列共计XXX个残基，匹配到的序列占总序列的XX%。

供试品重链的覆盖率（红色部分）

Q&A

1)    蛋白质类药物的多种内切酶的酶解。

大多数酶解试验中，常用的蛋白质内切酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Arg-C酶、Lys-C酶和Glu-C酶等等。不同蛋白质内切酶作用于不同的氨基酸残基末端，形成不同长度的多肽分子。因此对于肽段覆盖率的检测一般会采用多种酶解联合使用的策略，以提高质谱仪对肽段覆盖率的检测。

2)    是否使用高分辨率质谱进行蛋白质的覆盖率分析？

质谱仪发展已经到了“双高”的程度（高分辨率/高精度），超过10万分辨率的质谱仪大量涌现，分析精度更是小于1ppm。这些高端质谱仪对样品分析的准确度都大为提高，假阳性率大大降低。APT使用的高分辨率质谱仪Q Exactive（Thermo Scientific）将高性能四级杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数（HR/AM）Orbitrap检测技术相结合，提供优异性能和出色多功能性。其分辨率高达140,000，最大扫描速率12Hz，扫描间动态范围 >5000:1，S-Lens离子源，提供更佳灵敏度。采用高分辨质谱仪进行蛋白质的覆盖率分析可大大提高检测的准确性。