双链DNA（dsDNA）定量试剂

 产品信息

 双链DNA（dsDNA）定量试剂产品描述

Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建，DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义。疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。

常用的检测核酸的方法有:1）紫外吸光法（A₂₆₀），该法操作简便，但DNA样品中核苷酸、单链DNA、RNA和蛋白质对紫外吸收信号影响很大，还容易受到核酸样品中污染物的干扰，不能区分DNA和RNA，而且灵敏度低（ΔA₂₆₀=0.1相当于5ug/ml的dsDNA）；2）探针杂交法，该法是传统检测微量DNA的常用方法，基本能满足目前疫苗和治疗性生物制品的检测需求，但是该法耗时较长，操作繁琐，稳定性、敏感性和特异性较差；3）Hoechst33258染料法，Hoechst33258是一种一定程度上特异于双链DNA的核酸染料，基本不受蛋白质的干扰，可以检测低至10ng/ml的DNA；在检测稳定性和灵敏度上仍达不到理想效果。

Picogreen dsDNA定量法：Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。

相比传统的方法，Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势：①灵敏度高：数量级较UV吸光读数更敏感，可节省宝贵的样品；②特异性强：在等摩尔的RNA存在的条件下，对dsDNA具有特异性；③耐受性好：耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖，可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。④易于使用——只需在样品中加入染料，等待5分钟，然后读数即可，且适用于96和384孔板；与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。⑤适用范围广：可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。

若每次分析体积为2 mL，1ml Picogreen定量试剂足够200次分析使用，若使用微孔板或96孔板检测，每次使用量200µl，则足够2000次分析。根据不同客户需求，该试剂以不同形式提供：Cat#10224ES01以每管100µl，共10管提供；Cat#10224ES02以1管1ml的形式提供。另外，翊圣提供【双链DNA（dsDNA）定量检测试剂盒（Cat#10225）】方便客户选用。

 双链DNA（dsDNA）定量试剂运输和保存方法

室温运输。4℃避光干燥保存，有效期6个月。

 双链DNA（dsDNA）定量试剂注意事项

1）Picogreen定量试剂含有DMSO（已知有毒试剂），请小心操作；

2）尽管目前尚未有数据表明Picogreen具有诱变性和毒性，但是该试剂能结合双链DNA，请操作时务必小心。

应用实例

【注】：本方法参照2010《中国药典》进行操作的，如结果要求不是特别严格，可参照Yeasen 【双链DNA（dsDNA）定量检测试剂盒（Cat#10225）】的标曲制备方法。

1、染料工作液的配置

PicoGreen dsDNA定量试剂取出后回温至室温，该试剂是以1mL的浓缩液形式保存于无水DMSO中的。实验当天，根据实验用量用1×TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）按1:200 的比例稀释PicoGreen浓缩液。如，要准备足够的操作溶液测定20个样品，可在19.9mL1×TE 中加入100μL PicoGreen dsDNA 定量试剂。

 双链DNA（dsDNA）定量试剂【注】：a、由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。

b、PicoGreen试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用铝箔包住或放置暗处避光保存。

c、溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。

2、标准品工作液的配制

小牛胸腺嘧啶DNA干粉（Sigma货号：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1mL无菌去离子水（无Dnase），配制成1mg∕mL的标准品工作液。

【注】：标准品也可用λDNA或其他已知浓度的纯化DNA。

3、标准品工作液稀释

1）母液稀释：取10µl（1mg∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成10µg∕mL，取10µl（10µg∕mL）标准品工作液加入到990µl TE溶液中，浓度稀释成100ng∕mL；

2）倍比稀释：取800µl （100ng∕mL）的标准品工作液加入到200µl TE溶液中，浓度达到80ng∕mL，取500µl（80ng∕mL）的标准品工作液加入到500µl TE溶液中，浓度稀释到40ng∕mL；依次倍比稀释，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液；

3）标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100µl混匀，避光室温放置5min。使用FB-15型便携式荧光仪检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/ml）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线。

4）测量剩余样品的荧光值。荧光计将给出一个直接的浓度读数，数据可以用来产生DNA 浓度的标准曲线。

4、结果分析

   表1 标曲测定荧光值                                                                             图1 标准曲线图 

          YB