Waters常规反相色谱柱安装及使用维护指南

何谓常规反相色谱柱？

在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱填料所装填的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。反相是液相色谱中常使用的分离模式，而C18柱是常使用的反相色谱柱之一。

新色谱柱开启和安装的推荐步骤：

1. 使用新鲜洁净的水与乙腈。冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。
2. 取用色谱柱时避免磕碰掉落。
3. 将色谱柱入口端连接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头标明正确流向。
4. 在0.1 mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5 mL/min。
5. 当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）。
6. 重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。
7. 参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。
8. 测试柱效。如果没有柱效测试报告中的分析物，请联系沃特世化学消耗品部门寻求支持，使用合适的浓度与进样量。柱效结果略低于柱效测试报告属正常情况。如结果明显偏低、峰形拖尾，提示色谱柱和/或所使用的液相系统处于非理想状态，需要进行故障排查。

柱清洗与再生的推荐步骤：

压力升高，色谱柱峰形发生变化如出现严重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分离度降低，这些都强烈提示色谱柱受到污染。可采用以下步骤处理：

1. 如系统接有在线过滤器和保护柱，首先排查在线过滤器与保护柱，进行更新替换。日常操作中，当压力升高10%或柱效降低10%时，就应考虑更换在线过滤器和/或保护柱。
2. 使用高比例的有机溶剂进行冲洗（请注意避免盐析出，通常可使用梯度升高法，然后维持在高比例甚至100%有机溶剂条件下）。此操作通常可洗去大部分污染物。
3. 如有机溶剂清洗不能解决问题，可采用如下方法进行色谱柱的清洗和再生。根据样品性质以及你所了解的污染物性质选择清洗方法，用20倍柱体积（即，对于4.6x250 mm柱，相当于80 mL）的HPLC级溶剂清洗色谱柱，将流动相温度升至35-55˚C可提高清洗效率。（注：该说明摘选自waters产品目录2017-2018版本81页）

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