T7 耐热RNA聚合酶2.0

描述： T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0 是一种经基因工程改造 的 DNA 依赖性 RNA 聚合酶，对 T7 噬菌体启动子 （TAATACGACT CACTATAG）具有高度特异性，跟野生 型噬菌体 T7 RNA 聚合酶相比，它可在更高的温度下进 行体外转录。T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0 可在 37-52℃条 件下进行高效的体外转录，最佳温度为 37℃，50℃反应 条件下，仍然保留 50%以上的活性（野生型在此温度下 无活性）。这种高温的反应特性有益于以下几个方面的实 验：（1）提升了 GC 含量较高 RNA 的转录效率；（2）提 升了长片段 RNA 的合成能力；（3）在使用帽类似物时， 提高了共转录的加帽效率；（4）减少了 dsRNA 副产物 的形成，降低了合成 RNA 的免疫原性。 组分 名 称 5 KU 25 KU T7 RNA Polymerase 2.0 (50 U/μl) 100 μl 500 μl 5X T7 Transcription Buffer 1 ml 1 mlX5 活性定义：在标准反应体系下，50℃ 1 小时内将 1 nmol 的 ATP 掺入酸不溶物所需要的酶量定义为一个活性单 位。 1X T7 Transcription Buffer：40 mM Tris (pH 7.8), 20 mM NaCl, 18mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 酶储存液：10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。 储存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反复冻融。 热失活：75°C，10min。 其它体外转录辅助试剂： 名 称 货号 rNTP Mixture（25mM Each） A0304 RNase Inhibitor （40U/μl） D1101 RNaseFree DnaseI D3001 热稳定无机焦磷酸酶 C5007 5minRNA纯化试剂盒 B0133 Poly(A) Polymerase (E.coli) C1601 操作方法 1.配制反应体系 5XT7 Transcription buffer 4 μl rNTP Mixture（25 mM each） 3.2 μl Linearized template DNA 0.2~1 μg RNase Inhibitor（40U/μl） 0.5 μl T7 RNA Polymerase 2.0 (50 U/μl) 1-2 μl Rnase Free H2O up to 20 μl 2. 50℃孵育 1-3h。 3. 使用 RNaseFree DnaseI 去除 DNA 模板（可选） 在体外转录反应结束后，向上述 20μl 反应液中加入 5μl 的 10×RD Buffer 和 2μl RNaseFree DnaseI(10U/μl)， 并加入 23μl 的 Rnase Free H2O 至 50μl，37℃孵育 15min。 4. 转录产物的纯化 体外转录产物可选用 5minRNA 纯化试剂盒进行柱式纯 化，以去除多余的盐、蛋白等杂质。也可以采用经典的 LiCl 沉淀法（Protocol 可致电 索取）。 注意事项 1. 转录DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化 质粒和PCR产物作为模板。 2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒 DNA抽提过程中残留的RnaseA会显著影响转录RNA的 质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板。 3. 该酶对高浓度 NaCl 或 KCl 不耐受，当其浓度高于 150mM 时，其活性受到显著抑制（~50%）。 4. 在 20μl 反应体系中加入 0.02U 热稳定无机焦磷酸酶可 显著提高转录产量（提高 25~50%）。

T7 RNA 聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，并可以其作为启动子，DNA作为模板体外合成正义链或反义链RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA 聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。 正义或反义RNA链取决于模板DNA序列与T7启动子的位置，DNA位于T7启动子的下游，T7 RNA聚合酶会转录出正义RNA，反之则为反义RNA链。 提供两种T7 RNA 聚合酶：野生型（A3601）和耐热型（A3603/A3604）。野生型T7 RNA 聚合酶可在37℃对模板进行高效体外转录，与野生型噬菌体 T7 RNA 聚合酶相比，T7耐热RNA聚合酶可在更高的温度下进行体外转录。它可在37-52℃条件下进行高效的体外转录，最佳温度为37℃，50℃反应条件下仍然保留50%以上的活性，而野生型在此温度下无活性。基于此耐热的体外转录反应特性具有以下优势：（1）提升了GC含量较高RNA的转录效率；（2）提升了长片段RNA的合成能力；（3）在使用帽类似物时，提高了共转录的加帽效率；（4）减少了 dsRNA 副产物的形成，降低了合成 RNA 的免疫原性; (5)提升NASBA和CRISPR核酸扩增检测性能。该系列酶均来自重组 E.coli BL21菌株纯化而得，无核酸酶污染。 T7耐热高产RNA合成试剂盒是基于T7 耐热RNA聚合酶而组建的试剂盒，产量超过 MegaScript T7 Transcription kit，可在体外高效合成多种类型的 RNA，如mRNA、lncRNA、shRNA等。利用T7 RNA 聚合酶2.0识别T7 promoter（TAATACGACTCA CTATA G G）以倒数第二个G碱基为起点开始转录，该试剂盒可以将少量样本进行高效转录，单次反应可获得高达150 μg 的产物，转录长度可达5000nt以上。利用该试剂盒得到的 RNA 适用于多种下游应用，如RNA结构和功能研究、核酸酶生物化学研究、RNase保护分析探针、印迹杂交、反义 RNA 及 RNAi 实验、微阵列分析、显微注射、体外翻译和 RNA 疫苗等。

应用

制备放射标记的 RNA 探针 合成用于体外翻译的 RNA 合成用于结构、加工和催化性能研究的 RNA 合成 RNA 反义链，调控基因表达

1X T7 Transcription Buffer

40 mM Tris (pH 7.8), 20 mM NaCl, 18mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 。

酶储存液

10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。

储存

-20°C可保存2年，避免反复冻融。

热失活

75°C，10min。

注意事项

1. 转录DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。 2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RnaseA会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板。 3. 该酶对高浓度NaCl或KCl不耐受，当其浓度高于 150mM时，其活性受到显著抑制（~50%）。 4. 在20μl反应体系中加入0.02U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量（提高25~50%）。

实例

1.野生型和耐热型T7 RNA聚合酶的耐热性能比较 以20ng DNA作为模板，分别在反应体系（20 μl）中加入100U的T7 RNA聚合酶和T7 耐热RNA聚合酶2.0进行体外转录，结果可见T7 耐热RNA聚合酶2.0在50°C仍具有较高活性，而野生型T7 RNA聚合酶在该温度下没有活性。

2.热稳定无机焦磷酸酶对转录产量的影响 在反应体系（20 μl）中加入0.02U的热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产物的产量。

3.以不同大小的线性化质粒作为模板，应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试 由结果可见：T7耐热RNA聚合酶2.0在50°C条件下仍具有理想的转录活性。

4.以不同大小的PCR产物作为模板，应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试 由结果可见：T7耐热RNA聚合酶2.0可有效转录>5000nt的RNA分子。

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