【用途】本试剂盒采用实时荧光 RT-PCR 方法检测偶蹄动物水泡皮、水泡液及 OP 液中的塞尼卡病毒（SVV）的 RNA，适用于 SVV 的检测、诊断和流行病学调查。

【原理】提取样品 RNA，在高效反转录酶的作用下，以 RNA 为模板，以引物为起点合成与 RNA 模板互补的 cDNA 链。在热启动 Taq 酶的作用下， 经高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异

DNA 片段的拷贝数放大一倍，经荧光素标记的探针与扩增的 DNA 杂交，利用 Taq 聚合酶的 5→3 外切活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号，根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。

【试剂盒组成】

【需要自备的器材】

1．试剂：核酸提取试剂。

2．仪器：离心机、荧光 PCR 扩增仪、-20℃冰箱、可调移液器（2µL、20µL 、200µL、1000µL）。

3．耗材：荧光 PCR 专用反应管、吸头（10µL、

200µL、1000µL）。

【使用注意事项】

1．建议与世纪元亨提供的柱式 RNA 核酸提取试剂盒配套使用。

2．实验过程中进行阴性对照和阳性对照样品的

质量控制。

3．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。

4．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增

区。严禁器材和试剂倒流。

5．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应完全融化，8000rpm 离心

15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取， 使用后立即放回-20℃。

6．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。

7．严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

配制，整个实验过程严格控制污染。

9．反复冻融试剂将降低检测灵敏度，本试剂盒应在 3 次内用完。

【样品采集】

病死或扑杀动物，取水泡皮及水泡液；待检活动物，取 OP 液 2～3 mL。2～8 ℃保存，送实验室检测。要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。

【实时荧光 RT-PCR 操作】

设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N， 则反应体系配制如下：

试剂 体系

无菌无核酸酶水 7（N+1）µL

RT-PCR 反应液 12.5（N+1）µL

酶混合液 1（N+1）µL

  荧光探针 2.5（N+1）µL

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各 23µL。分别取 2µL 模板 RNA，加入相应反应管中，混匀并作好标记，其中 SVV 荧光报告基团为 FAM，淬灭基团均为 None。在荧光 PCR 仪上进行以下反应：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每个循环第二步（60℃

35s）收集荧光信号，共 40 个循环。

【结果判定】

1 结果分析条件设定

阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。                         2 结果描述及判定

阳性对照 Ct 值≤30 并出现特异性扩增曲线， 阴性对照无 Ct 值并且无特异性扩增曲线，实验结果成立；被检样品若FAM 荧光信号 Ct 值≤30 并出现特异性扩增曲线为 SVV 阳性；被检样品 30

＜Ct＜36 并出现特异性扩增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品 Ct 值≥36 时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现特异性扩增曲线，但本底较高的样品，判为阴性。

【规格】50 头份/盒

【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期为 12

个