蛋白质印迹(Western blotting)
产品名称： 蛋白质印迹(Western blotting)
英文名称： Western blotting
产品编号： yb021
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使用范围： null
上海英拜生物科技有限公司
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免疫印迹技术服务
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
本公司为您提供全套免疫印迹(Western blotting)技术服务，全部实验皆使用高质量试剂完成。
实验步骤如下：
1.
蛋白质抽提
2.
蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.
变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)：将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.
蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜：按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.
膜的封闭和抗体孵育
6.
化学发光法检测：将A和B两种试剂等体积混合，均匀的加在膜上。数分钟后使用化学发光凝胶成像仪进行曝光，拍照。
7.
数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8.
提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。
常见问题
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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信号弱 |
封闭剂选择不当 |
封闭剂可能与待检测蛋白又亲合作用，因而阻碍蛋白检测 换一种不同的封闭剂和/或减少封闭剂的量和封闭剂时间 |
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抗体反应时间不够 |
增加保温反应时间 |
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抗体浓度太低或抗体无活性
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抗体液反复冻融或细菌污染会改变抗体滴度或活性。提高 抗体浓度或新鲜制备 |
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显色检测中印迹膜已干燥 |
用显色检测方法时如果对比度差，可能印迹膜已经干燥。 再次用水润湿印迹膜以提高对比度 |
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叠氮化物抑制HRP |
印迹溶液中禁止使用叠氮化物 |
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无信号 |
无蛋白转移 |
检查转移过程中凝胶和膜的定位，使用预染分子量标准检 测转移过程 |
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抗原上样量低 |
印迹前在凝胶中加入更多抗原 |
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抗体浓度过低 |
增加一抗和二抗浓度 |
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非特异性结合 |
一抗浓度过高、二抗浓度过高 |
提高一抗稀释度、提高二抗稀释度 |
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抗原浓度过高 |
减少加到凝胶中的蛋白量 |
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SDS 导致非特异性结合 |
转膜后洗膜，去除SDS |